高尔基体与缺血性脑损伤相关研究

高尔基体与缺血性脑损伤相关研究

提名单位：中南大学

提名奖种：湖南省自然科学二等奖 提名意见：

该项目组通过在亚细胞器高尔基体水平研究缺血性脑损伤的发病机制及其干预途径，揭示了高尔基体应激的具体内容和表现形式及其在缺血性脑损伤中的作用机制，并进一步阐明了包括高尔基体在内的各神经元亚细胞器的相互作用，为寻找新的高尔基体相关的脑血管病干预途径提供了重要依据。

该项目组通过原创性的努力，借由创新性的发现，完成了数项国家自然科学基金课题，发表SCI论文30余篇，8篇代表性的论文总影响因子达36.337，总他引次数118次，培养硕博士研究生30余人，取得了较为丰富的研究成果。故此，提名其为湖南省自然科学奖。

项目简介

该项目组通过研究高尔基体亚细胞结构在神经元体外氧化应激模型和大鼠脑缺血再灌注模型中形态和功能的改变，以高尔基体膜离子通道活性及其介导的高尔基体内外钙离子浓度变化，高尔基体碎裂，细胞组织氧化产物的形成，细胞凋亡，信号转导，神经功能缺损等为评价目标，研究发现了一系列高尔基体应激相关的标志性蛋白及其作用，如scaffold，GRASPs等，并且证实GOLPH3蛋白为高尔基体应激的标志性蛋白；项目在研究中阐明了高尔基体膜离子通道在氧化应激损伤中的重要作用，发现高尔基体膜离子通道SPCA2在氧化应激时表达和功能的异常导致了细胞内钙超载，从而引起细胞凋亡和组织损伤；项目揭示了高尔基体及其应激性改变在缺血性脑卒中中的作用和地位，发现脑缺血再灌注可导致高尔基体分泌途径离子通道Ca2+-ATPase2、 Golgin160蛋白等在大脑皮质及海马区的表达异常，这与缺血性卒中后神经元的凋亡及神经功能缺损有关。项目进一步阐明了在氧化应激状态下以高尔基体碎裂为标志的高尔基体形态学改变，还发现了高尔基体应激性损伤的新机制，如自噬溶酶体途径，热休克蛋白的作用等。

项目还模拟脑缺血再灌注的损伤路径，经由动物、细胞双重模型深入研究脑缺血时UBIAD1的表达特点和亚细胞定位， 探讨UBIAD1及产物在神经保护作用中的意义，并研究其介导的高尔基体、线粒体、内质网的交互作用及可能的保护机制。项目研究发现氧糖剥夺再灌注和缺血再灌注后UBIAD1的蛋白表达及mRNA 表达均出现明显下降，且UBIAD1的表达与再灌注损伤时程具有相关性，随着再灌注时间的延长，UBIAD1表达降低更加明显。同时，项目通过免疫荧光共聚焦

发现在N2A细胞中UBIAD1定位于多个亚细胞器包括线粒体，内质网和高尔基体。项目证实了UBIAD1对氧糖剥夺再灌注后N2a细胞具有保护作用，发现过表达UBIAD1能显著抑制氧糖剥夺再灌注损伤所诱导的细胞活力的衰减、乳酸脱氢酶的活性及细胞的凋亡率升高。项目发现UBIAD1的神经保护作用是通过多细胞器介导：UBIAD1过表达可明显减轻经氧糖剥夺再灌注损伤所诱导的线粒体碎裂现象，改善线粒体功能障碍，调节线粒体相关凋亡蛋白的表达水平；UBIAD1过表达可明显减轻经氧糖剥夺再灌注损伤所诱导的内质网形态结构的碎裂，抑制内质网应激蛋白GRP78的表达上调；UBIAD1过表达细胞组中明显减轻经氧糖剥夺再灌注损伤所诱导的高尔基体形态结构的碎裂，抑制高尔基体应激相关蛋白GOLPH3的表达上调。另外，项目还研究了UBIAD1介导神经保护作用的相关通路，研究发现使用PI3K/AKT信号通路抑制剂（LY294002）后， UBIAD1的保护作用被阻断，细胞活力衰减，乳酸脱氢酶的活性及细胞的凋亡率升高。这揭示了UBIAD1在OGD/R后通过上调PI3K/AKT信号通路发挥保护作用。

项目组通过细致研究和创新性的发现揭示了高尔基体应激的具体机制，阐明了高尔基体应激在缺血性脑卒中中的作用，为更深入研究以高尔基体为代表的亚细胞结构及其功能奠定了坚实基础，为寻找新的高尔基体亚细胞器相关的脑血管病干预途径提供了重要依据。

重要科学发现

1. 重要科学发现

经过项目组全体参与人的共同努力，经过近10年的时间，项目取得了一系列重要的科学发现，共完成二项国家自然科学基金面上项目，发表SCI论文28篇，共培养博硕士研究生39余名，现总结如下：

（一） 明确了一系列高尔基体应激相关的标志性蛋白，特别是其与细胞凋亡的关系，

从而揭示了高尔基体应激的具体机制，为研究高尔基体亚细胞结构及其功能奠定了坚实基础。我们发现：

1. 高尔基体碎裂与其基质蛋白GM130的ser25位点的磷酸化密切相关；GM130的磷酸化受到Cdk1激酶的调节，抑制Cdk1可以减少磷酸化GM130的表达，减轻高尔基体碎裂；

2. N2a细胞经H2O2处理后细胞氧化应激效应明显，导致高尔基体SMS1的mRNA及蛋白表达均升高，而氧化应激抑制剂D609可抑制N2a细胞的氧化应激效应及SMS1mRNA的表达；

3. 高尔基体碎裂拮抗蛋白GRASP65对氧化应激所致N2a细胞凋亡有重要影响。氧化应激可致细胞ERK及GRASP65表达上升，细胞磷酸化ERK表达升高，而细胞凋亡的机制与GRASP65有关；

4. 我们系统阐述了高尔基体特征性的scaffold蛋白的生理生化特征及其与细胞信号传导、亚细胞区间化的关系，明确了高尔基体特别是scaffold蛋白在细胞信号传导中的重要地位，揭示了高尔基体相关功能蛋白在缺血性脑卒中中的重要作用，相关成果发表文章如下：

Peng W, Lei Q, Jiang Z, Hu Z. Characterization of Golgi scaffold proteins and their roles in compartmentalizing cell signaling. J Mol Histol. 2014 Aug; 45(4):435-45

5. 我们系统地总结了高尔基体功能蛋白GRASPs在蛋白质组装，细胞分裂，细胞凋亡，蛋白分泌运输等方面的机制和原理，从而明确了GRASPs在高尔基体正常形态和功能中的作用。相关成果发表文章如下:

Guang Ji, Hui Ji, Xiaoye Mo, Ting Li, Yaduo Yu and Zhiping Hu. The role of GRASPs in morphological alterations of Golgi apparatus: mechanisms and effects. Rev. Neurosci. 2013; 24(5): 485–497.

6. 最重要的是我们研究发现了高尔基体应激的标志性蛋白GOLPH3，把高尔基体应激相关研究推向了一个新的高度。我们发现GOLPH3蛋白位于高尔基体外囊泡上，在神经细胞缺血缺氧等氧化应激相关损伤中介导了高尔基体的碎裂，参与了细胞凋亡等许多细胞内信号转导过程，其在脑缺血缺氧后表达明显增加，为脑梗死在高尔基体层面的干预提供了可能的靶点。相关成果发表高水平论文如下： Li T, You H, Zhang J, Mo X, He W, Chen Y, Tang X, Jiang Z, Tu R, Zeng L, Lu W, Hu Z. Study of GOLPH3: a potential stress-inducible protein from Golgi apparatus. Mol Neurobiol. 2014 Jun;49(3):1449-59

Li T, You H, Mo X, He W, Tang X, Jiang Z, Chen S, Chen Y, Zhang J, Hu Z. GOLPH3 Mediated Golgi Stress Response in Modulating N2A Cell Death upon Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation Injury. Mol Neurobiol. 2015 Jan 30.

（二） 明确了氧化应激对高尔基体结构和功能的重要影响

1. 氧糖剥脱/复氧所形成的氧化应激效应使细胞内高尔基体碎裂，从缺氧

4h开始，在复氧48h最明显，高尔基体的碎裂是细胞的凋亡的重要原因；

2. H2O2所造成的氧化应激效应使细胞内氧自由基及其产物明显升高，在这

一过程中神经元细胞高尔基体发生碎裂变形，呈现浓度和时间依赖性，继而神经元凋亡增加。

3. 氧化应激使高尔基体相关功能蛋白如GOLPH3等的表达异常，从而影响了

高尔基体的功能。

（三） 阐明了高尔基体膜离子通道在氧化应激损伤中的重要作用

1. 我们发现高尔基体膜离子通道SPCA2在大鼠脑缺血再灌注损伤后的皮层 中表达明显下降，脑组织神经细胞的SPCA2水平与脑缺血再灌注损伤存在明显的应答关系；在大鼠脑缺血/再灌注期，SPCA2表达的下调引起胞质内钙超载是氧化应激的重要机制；该研究成果发表论文如下:

Lu TL, Hu ZP, Zeng LW, Jiang Z. Changes in secretory pathway Ca2+-ATPase 2

following focal cerebral ischemia/reperfusion injury.Neural Regen Res. 2013;8(1):76-82.

He W, Hu Z. The role of the Golgi-resident SPCA Ca2+/Mn2+ pump in ionic homeostasis and neural function. Neurochem Res. 2012 Mar;37(3):455-68.

（四） 明确了高尔基体及其应激性改变在缺血性脑卒中中的作用和地位

1. 我们利用大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，成功发现高尔基体分泌途径

离子通道Ca2+-ATPase2在大鼠大脑皮质及海马区表达下调，这说明高尔基体在氧化应激及缺血性脑卒中中具有重要作用和地位，为潜在的缺血性脑卒中在高尔基体层面的干预提供了依据。相关研究论文如下：

Lu TL, Hu ZP, Zeng LW, Jiang Z. Changes in secretory pathway

Ca2+-ATPase 2 following focal cerebral ischemia/reperfusion injury.Neural Regen Res. 2013;8(1):76-82.

2. 我们发现大鼠缺血再灌注后脑组织MLK3表达水平增高，Golgin160表达

减少，并出现裂解，而磷酸化Golgin-160表达增加，MLK3定位于高尔基体上MLK3在神经元细胞内的分布与Golgin160重叠，因此脑梗后MLK3的改变与高尔基体应激相关脑梗死灶的形成有关。

3. 我们发现沙鼠脑缺血再灌注损伤后高尔基体相关蛋白的表达异常，与高

尔基体应激相关脑损伤有关，相关成果发表论文如下：

Li T, Mo X, Jiang Z, He W, Lu W, Zhang H, Zhang J, Zeng L, Yang B, Xiao H, Hu Z.

Study of αB-crystallin expression in Gerbil BCAO model of transient global cerebral ischemia. Oxid Med Cell Longev. 2012;2012:945071.

（五） 发现了高尔基体应激性损伤的新机制

1. 我们发现自噬溶酶体途径对对高尔基体应激有重要影响。细胞在氧化应激时自噬溶酶体途径被激活，药物阻断自噬溶酶体途径后细胞凋亡率增加，其机制与自噬溶酶体途径保护高尔基体SPCA1在氧化损伤时的功能完整性，并使SPCA1的表达增加，从而减轻细胞内的钙超载有关。因此，自噬这一重要的细胞内机制在氧化应激相关神经损伤中具有重要作用，以高尔基体为中心的细胞内多亚细胞结构在氧化应激时存在交互作用和影响。相关成果发表论文如下：

Hu Z, Yang B, Mo X, Xiao H, Mechanism and regulation of autophagy and its role in neuronal diseases. Mol.Neurobiol. 2014 Oct 15.

2. 急性酒精作用可导致细胞类似氧化应激的效应，而酒精所致氧化应激效应可致细胞内高尔基体相关的ATP2C1表达增加，并加重细胞内钙离子浓度超载；

3. 我们还发现热休克蛋白与高尔基体应激之间的密切关系，热休克蛋白20可以减轻高尔基体在氧化应激时的结构碎裂，进而影响细胞凋亡，这揭示了高尔基体应激的另一重要调节机制，相关成果发表文章如下：

Zhong B, Hu Z, Tan J, Lu T, Lei Q, Chen C, Zeng L. Hsp20 Protects against Oxygen-Glucose Deprivation/Reperfusion-Induced Golgi Fragmentation and Apoptosis through Fas/FasL Pathway. Oxid Med Cell Longev. 2015;2015:6029-34. （六）

我们证实了UBIAD1具有神经保护作用

1. 我们研究发现UBIAD1过表达能显著抑制氧糖剥夺再灌注损伤后N2a细胞

活力的衰减、乳酸脱氢酶的活性及细胞的凋亡率升高。我们进一步证明了高尔基体、线粒体和内质网是UBIAD1 在脑缺血再灌注损伤中发挥神经保护作用的重要靶点，过表达UBIAD1 可以减轻线粒体、高尔基体碎裂，降低ROS 生产，减少线粒体促凋亡相关蛋白的活化及释放，上调高尔基体SPCA1、GOPLH3 等保护性蛋白表达，下调内质网应激UPR 相关蛋白的表达。这提示UBIAD1 是一个具有良好应用前景的神经保护剂，为脑缺血的临床治疗提供了新的治疗靶点。相关文章已发表如下：