第一讲
微生物的利用
对应学生用书P218
知识点一 微生物的培养和分离 1．培养基的成分和分类
(1) 微生物的营养：碳源、氮源、生长因子、水和无机盐。 (2) 培养基的类型：
①按物理性质分：固体培养基、半固体培养基、液体培养基。 ②按目的用途分：鉴别培养基、选择培养基。 2．灭菌操作 (1)无菌操作的概念：
无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。主要包括：各种器皿必须无菌；培养基也必须要无菌；转移菌种时不能带入其他杂菌。
(2)消毒和灭菌的区别： 条件 较为温和的物理或化学方法 结果 仅杀死物体表面或内部一消毒 部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子) 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或化学药物消毒法 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌 常用的方法 灭菌 强烈的理化因素 3.培养和纯化大肠杆菌 (1)大肠杆菌：革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。
(2)大肠杆菌培养：LB液体培养基(通用的细菌培养基)——扩大培养；LB固体培养基——分离纯化，鉴定菌种。
(3)大肠杆菌的培养和分离实验步骤：
配制培养基(称量、溶化、调pH)→灭菌→制作平板→扩大培养→划线分离→菌种保存。 (4)分离方法：划线分离法(方法简单)和涂布分离法(单菌落更易分开，但操作复杂)。 知识点二 分离以尿素为氮源的微生物 1．实验目的
(1)使用专一的培养基(含尿素)分离专一的细菌(有脲酶的细菌)。 (2)使用指示剂(酚红)颜色的变化检知酶(脲酶)所催化的反应。 2．实验原理
由于有些细菌能产生脲酶向周围扩散，将培养基中的尿素分解，产生氨使培养基变碱性，于是酚红由黄色变成红色。
(NH2)2C＝O＋H2O――→2NH3＋CO2 3．实验步骤
制备平板→制备细菌悬液→涂布分离法分离细菌→倒置培养→观察计数。 4．实验结果 (1)与稀释度为10
－5
脲酶
相比，培养基中的平均菌落数在10
－4
处理中多。
(2)在相同稀释度的情况下，尿素培养基中的平均菌落数少于LB培养基中的平均菌落数，其原因是大多数微生物不能利用尿素为氮源。
(3)在尿素培养基上的菌落周围会出现红色的环带。
考点一|培养基及微生物的纯化培养技术?对应学生用书P219?
1．培养基营养要素
基本营养要素：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐。此外还要满足不同微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的需求。
营养要素 碳源 无机碳源 来源 CO2、NaHCO3、CaCO3等含碳无机物 功能 ①构成细胞中的物质和一些代谢产物； 有机碳源 糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油、花生粉饼等 无机氮：NH3、铵盐、硝酸盐、N2等 牛肉膏、蛋白胨、核酸、尿素、氨基酸 维生素、氨基酸、碱基 ②既是碳源又是能源 氮源 无机氮源 将无机氮合成含氮的代谢产物 合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物 ①酶和核酸的组成成分；②参与代谢过程中的酶促反应 有机氮源 生长因子 [特别提醒] (1)微生物最常用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常利用的氮源是铵盐、硝酸盐。 (2)对异养微生物来说，含C、H、O、N的有机化合物既是碳源，又是氮源、能源。 (3)有些培养基不需要添加特殊营养物质，生物自己能合成，如大肠杆菌能合成某些维生素，作为特殊营养物质。
2．微生物的纯化培养 方法 划线分离法 (1)接种环的灼烧： ①第一次划线前：杀死接种环上的微生物，避免污染培养物 ②每次划线前：杀死残留菌种，保证每次划线菌种来自上次划线末端 注意事项 ③划线结束后：杀死残留菌种，避免污染环境和感染操作者 (2)灼烧接种环之后，要冷却后再进行操作，以免温度太高杀死菌种 (3)划线时最后一区域不要与第一区域相连 (4)划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破 涂布分离法 (1)稀释操作时：每支试管及其中的水、移液管等均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰1～2 cm处 (2)涂布平板时： ①涂布器用体积分数为70%酒精消毒，取出时，让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃 ②不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精 ③酒精灯与培养皿距离要合适，移液管管头不要接触任何物体 [典例1] 右图是微生物平板划线示意图。划线的顺序为1、2、3、4、5。下列叙述正确的是( )
A．在五个区域中划线前后都要对接种环和培养基进行灭菌 B．划线操作时完全打开皿盖，划完立即盖上
C．接种时不能划破培养基，否则难以达到分离单菌落的目的 D．第1区和第5区的划线最终要连接起来，以便比较前后的菌落数
[解析] 在每次划线前后都要对接种环进行灭菌；进行划线操作时，左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖；注意接种时不能划破培养基，否则难以达到分离单菌落的目的；第1区和第5区的划线不能相连。
[答案] C
1．消毒和灭菌的辨析 项目 条件 结果 仅杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物 常用方法 煮沸消毒法 消 毒 较为温和的物理或化学方法 紫外线 消毒法 化学药剂 消毒法 灼烧灭菌法 杀死物体内外灭 菌 强烈的理化因素 所有的微生物，包括芽孢和孢子 过滤灭菌 2．大肠杆菌的培养和分离应注意的几个问题
(1)在倒平板过程中，不能将培养基溅在皿壁与皿盖上，防止杂菌污染。 (2)本实验需设置空白培养基在相同条件下一起培养，以确定是否有杂菌污染。 (3)培养皿倒置的目的是防止皿盖上的水珠落入培养基中难以形成单菌落。
(4)实验操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
[针对练习]
1．细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌( )
干热灭菌法 高压蒸汽 灭菌法 应用范围 日常用品 接种室、超净台 用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源 接种工具 玻璃器皿、金属工具 培养基及容器的灭菌 不能加热灭菌的化合物，要用G6玻璃砂漏斗过滤 A．接种环、手、培养基 C．培养基、手、接种环
B．高压锅、手、接种环 D．接种环、手、高压锅
解析：选C 一般说来灭菌是指彻底杀灭微生物使其永远丧失生长繁殖的能力，对于培养基、操作器皿和接种环等都需要灭菌。消毒仅指杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌而对被消毒的物体基本无害，如操作者的手臂需要消毒处理。高压蒸汽灭菌锅是灭菌设备，通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环。
2．(2014·全国卷Ⅱ)为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：
(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是________________；然后，将1 mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为________。
(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过________灭菌，在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线。这样做的目的是__________________________。
(3)示意图A和B中，________表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。
(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中____________的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高________的利用率。
解析：(1)为了检测培养基平板灭菌是否合格，可在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间。0.1 mL稀释液中平均有38个活菌，可推测每升水样中的活菌数＝38×10×100×1 000＝3.8×107(个)。(2)接种环、接种针或其他金属用具直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌。在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，其目的是将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。(3)比较两图可以看出，A是用平板划线法接种培养后得到的结果，B是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。(4)由于振荡培养可以提高培养液中溶解氧的含量，还可以使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率，因此振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。
自选模块选修1 生物技术实践
