1. 神经干细胞在HD动物模型体内移植 按多种组合形式，利用毛细显微注射器将经多种形式基因转染的神经干细胞注射到HD无神经节细胞段；参考文献报道进行，将注射细胞浓度定为0.5-1 cell/ 0.5ul。 2. 移植后的神经干细胞在HD动物体内的分化诱导 维甲酸等分化诱导剂处理，药物浓度选择参考文献。 3. 移植后的神经干细胞对HD动物模型无神经节细胞段肠神经系统的影响检测 A．实验动物的处理：将实验组鼠（包括对照组）分别于不同时期断颈处死，如移植后4周，16周，32周。取移植处肠组织进行检测，分别按进行检测的项目要求对样本进行处理。 Ｂ．光镜及电镜检测移植处组织形态学变化。 Ｃ．免疫组化技术：检测神经细胞特异性烯醇化酶（NSE），Ｓ-100，GAFP等表达。 Ｄ．原位杂交，RT-PCR检测：转染基因的表达（V-MYC，EGF等），原位杂交所需探针，RT-PCR引物可分别购自中山，GIBIC公司，按说明进行实验操作。 Ｅ．功能鉴定：直肠测压技术，生物化学方法检测r-氨基丁酸，P物质等的合成。 4. 神经干细胞移植，分化的分子机制 参照文献利用mRNA差异消减显示技术显示以上多种形式神经干细胞移植，分化的差异基因，进而进行分级分段克隆。 A. 神经干细胞移植处肠段及相同部位正常肠神经组织RNA的纯化：利用肠道组织的剥片技术获取肠神经组织，立即置放于液氮中，-70保存。氯仿法提取RNA，DNase I 处理，紫外分光度计定量测定。 B. RT-PCR差异消减显示：对分别将神经干细胞移植处肠段及相同部位正常肠神经组织分离扩增出cDNA，运用5端帽子引物与3端锚定引物，对cDNA进行大量扩增，正常肠神经组织用生物素标记的dATP和dNTPs进行PCR扩增，产物进行消减杂交，用连亲和素去除共有产物，剩下的产物由带有[?-32 P]dATP的dNTPs进—5-3— 、、行PCR，在重复差异显示，回收差异条带并克隆。（0.4ul RNA，1?逆转录缓冲液，15umol/L dNTP, 10umol/L简并引物，65C 5min，37C温育10min，加200U/ulMoMuLV反转录酶，37C温育50min，95C 温育5min，PCR，消减杂交，过柱子，PCR，消减杂交，TA克隆盒进行DNA克隆，按说明进行，及进行测序，基因鉴定等）。 5. 结合步骤3的检测结果再进行神经干细胞的基因转染 同第三部份的体外基因转染。 6. 获得神经干细胞基因转染，移植，分化，重建HD正常神经支配的方案 重复步骤1；2；3；4，反复调整。 第五部分：统计分析 各实验组间的数据以 均数 ? 标准差表示，用F检验，t检验，多因素方差分析进行多组及组间统计学处理，P值小于0.05为差异显著。 可行性分析： (1) (2) MSC分离，体外培养，本课题组已经完成。 本课题组已前期进行了MSC转化为神经干细胞的实验，同时成功进行了体内神经干细胞的分离并获得了国家自然科学基金支助（编号30070382）。 (3) 神经干细胞移植为当今各国神经细胞工程研究重点，大量的研究文献报道了神经干细胞分离，培养的方法。 (4) (5) (6) 较其它一些干细胞研究不同，神经干细胞有明确的免疫标记。 在临床及研究中对大量先天性巨结肠症进行了观察，有多篇相关文献发表。 课题组已成功进行了神经干细胞的分离培养与鉴定，及成人骨髓MSC体外扩增和定向诱导分化为骨和软骨细胞。 。。。。
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3．本项目的创新之处 （1） 以往对神经干细胞移植的研究主要局于中枢神经系统及脊髓损伤修复方面，虽然有类似于神经干细胞的神经嵴细胞修复肠神经节缺如的文章报道，但神经干细胞移植修复肠神经节缺如尚未见报道。 （2） 4. 年度研究计划及预测进展 （1） 2002年1月~2002年12月 构建HD动物模型及初步完成MSC分离，体外培养，及向神经干细胞转化。 （2） 2003年1月~2003年12月 完成神经干细胞的各种基因转染实验，初步完成HD动物模型的无神经节细胞段的神经干细胞注射及检测。 （3） 2004年1月~2004年6月 进一步完成HD动物模型的无神经节细胞段的神经干细胞注射及检测，获得MSC转化为神经干细胞后移植分化重建HD正常神经支配的方法。 （4） 2004年6月~2004年12月 数据处理，完成论文。 5. 预期研究成果 以论文发表作为研究成果。 首次提出MSC转化为神经干细胞后，移植分化修复HD正常神经支配可能。 －6－
四、研究基础
1. 与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩 （1） 本项目的提出源于课题组对先天性巨结肠症长期的临床及基础研究，既往主要将注意力集中在手术方法的改进，病理生理学变化观察上，已有多篇相关文章发表。 （2） 本课题组对多个年龄组的正常个体及先天性巨结肠症患者进行了神经节发育观测，并对人巨细胞病毒与先天性巨结肠症的关系进行了研究。 （3） 对数百例先天性巨结肠症患者进行了诊治，有较丰富的临床经验。 （4） 已成功地建立了神经干细胞的培养。 （5） 本课题组成员已进行了MSC转化为神经干细胞的实验，并获得了国家自然科学基金资助（编号30070382）。 （6） 本课题组较熟练地掌握了基因转染技术，效果优良。 2. 已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径（包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况） 本研究室所在的重庆医科大学儿科研究所为原四川省重点实验室，现已重新评定为重庆直辖市重点实验室，目前正在申报国家级及教育部重点实验室，是博士授权点并可培养博士后人员。有高级职称人员100多人。儿科研究所专业门类齐全，技术力量雄厚，设备完善，具有包括中心实验室在内的涉及分子生物学、分子遗传学、细胞生物学、组织病理学、生物化学、免疫学、微生物学以及急救医学、小儿肿瘤实验外科学等专业实验室、研究室十余个，能承担国家重点科研课题及博士后研究工作。多年来，已完成包括国家自然科学基金资助项目在内的部、委、省、市级科研课题上百项，并获多项各级奖励。 主要设备及实验条件包括： １．扫描、透射电镜 ２．高压液相色谱仪 ３．显微成像系统 ４．石蜡，冷冻，恒冷，超薄切片机 ５．荧光，相差，倒置，自动照相显微镜 ６．PCR仪 －7-1—
７．细胞培养全套设备 ８．荧光分光光度计 ９．紫外分光光度计 １０． LKB 电泳仪器 １１． 低温超速离心机 １２． 超低温冰箱，低温冰柜 １３． 超声细胞粉碎仪 １４． 去离子水发生器 １５． 分子生物学实验常用设备 １６． 动物实验检测维持设施 １７． 二氧化碳孵箱 １８． 其他辅助设备 １９． 其它本次实验需要，但缺少的设备，如DNA测序分析仪等可通过测序公司解决或联系国家干细胞研究重点实验室解决。 —7-2—
国家自然科学基金申请书范本
