且此类患儿病变肠段不仅有神经节异常，尚有肠道平滑肌，结缔组织的增生等细胞外基质变化，单纯的神经嵴细胞移植一方面神经嵴细胞来源受限，另一方面能否在体内改造病变肠段的病理变化，仍需进一步研究。 近年来干细胞的基因修饰治疗发展较快，国外有人发现将表达神经营养因子的神经干细胞直接种植于受伤的脑组织中，能促进神经功能的恢复。神经干细胞在受到碱性成纤维细胞因子（FGF-2）和上皮细胞生长因子（EGF）刺激时可分化出神经元和胶质细胞，EGF可维持神经干细胞的生成，FGF-2对干细胞的分化起重要作用；有很多神经因子（如血小板生长因子，转化生长因子等）对神经干细胞的分化起着协同作用。诱导分化剂维甲酸对神经干细胞也有诱导分化作用。对于HD病变肠段不仅有神经节异常，尚有肠道平滑肌，结缔组织的增生等变化的现象，我们注意到纤溶酶原激活因子（PA）能激活纤溶酶原，水解纤维蛋白，及细胞外基质中的纤连蛋白(fibronectin, Fn)，层粘连蛋白（laminin，Ln），基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase enzyme, MMP）能分解周围组织—细胞外基质，如将PA，MMP的cDNA转染修饰神经干细胞将有可能对HD病变段的病理变化进行改造，有利于神经干细胞生长，发育。通过探索影响神经干细胞移植，生长，分化的分子机制，结合基因工程技术，将可为神经干细胞移植治疗成功创造条件。 鉴于神经干细胞的多向分化潜能，在大脑，脊髓中的损伤修复研究中令人鼓舞的发现，自体造血干细胞等分化为神经干细胞可能性的提出[4] （此将为神经干细胞自体移植提供一个很好的来源），以及神经干细胞目前被认为是一种更优于成纤维细胞的基因治疗的载体细胞[5]，针对上面的问题我们提出如下假说：如同神经干细胞移植在恢复受损大脑，脊髓神经功能上具有良好的应用前景一样，通过各种人工方法修饰后，神经干细胞移植有恢复HD 病变肠段的正常神经支配的可能。 细胞移植虽然已被认为对于修复神经组织是有效的治疗方法，但目前使用的细胞多取自胚胎，这样一方面细胞来源有限，另一方面存在异体免疫排斥作用。神经干细胞可以在体外大量增殖，但目前主要在海马和室管膜下层发现有神经干细胞分布，这样造成了神经干细胞来源困难。骨髓中有两类干细胞，即造血干细胞和间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC）。前者的移植已成功用于临床治疗白血病，但其移植需要获得足够数量的造血干细胞，并且造血干细胞体外扩增存在困难。MSC易于从骨髓中分离，体外扩增简单，长期培养过程中能保持多向分化潜能。近期美国学者Woodbury等在—3-2—
[3]体外实验中成功地将源于成年大鼠及人骨髓MSC转化为神经干细胞, 并进而分化为神经元。此研究结果很好地解决了神经干细胞来源困难的问题，为今后神经干细移植治疗多种神经系统疾病打下了基础。 总之，随着当今干细胞研究的深入，探索通过MSC转化为神经干细胞恢复小儿外科常见疾病（先天性巨结肠症）正常神经支配的方法具有重要现实性及可能性。 美国?时代?周刊曾将人类胚胎干细胞（ES细胞）和胚胎生殖细胞（EG 细胞）建系研究成功列为20世纪末世界十大科技成就之首，并认为ES细胞和人类基因组将同时成为新世纪最具发展和应用前景的领域。由此激发了人们对ES细胞，骨髓干细胞，神经干细胞定向分化的研究。将MSC,神经干细胞定向分化，移植的研究引入到HD这一小儿外科常见病的治疗研究中，探索MSC，神经干细胞克隆、定向分化、移植对于HD治疗方法，可为发育生物学积累宝贵的资料；采用细胞工程原理和方法，通过MSC，神经干细胞移植重建HD病变段的正常神经支配方法的研究成功，在临床上将可以让HD患儿免于手术，使HD的治疗发生根本性的改观。该课题的完成除能为儿童的健康成长做出巨大贡献，并能带动本地区整个小儿外科水平的发展，提高本地区小儿外科在国内及国际上的地位，为祖国西部大开发战略的顺利进行贡献力量。 [6]参考文献 (1) 陈雷玲，胡廷泽，朗诗明，等。320例先天性巨结肠症的诊断与治疗分析。华西医科大学学报，2000，31(2)：274-27 (2) Kathryn S. Embryonic stem cells used to remyelinate injured rat spinal cord neurons. Lancet, 2000, 355 (9218): 1890 (3) McCaffery P, Drager UC. Regulation of retinioc acid signaling in the embryonic nervous system: a master differentiation factor. Cytokine Growth Factor Rev. 2000, 11(3): 233-249 (4) Natarajan D, Grigoriou M, Marcos-Gutierrez CV, et al. Multipotential progenitors of themammalian enteric nervous system capable of colonizing aganglionic bowel in organ culture. Development, 1999,126:157-168 (5) 刘平，卢亦成，朱诚。中枢神经干细胞。中华神经外科杂志。2000，16（3）：196-198 (6) Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, et al. Ault rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res, 2000, 61(4): 364-370 —3-3—
三、研究方案
1. 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题 研究目标： 探索建立针对先天性巨结肠症的MSC，神经干细胞移植治疗方法。 研究内容： １．MSC的分离，体外克隆； ２．MSC向神经干细胞的转化； ３．多种人工修饰条件下的神经干细胞在HD动物模型（lethal spotted rat, ls/ls）无神经节细胞肠段移植，定向分化； ４．鉴定神经干细胞移植后HD动物模型的消化道神经系统形态及机能。 拟解决的关键问题： １．MSC向神经干细胞的转化； ２．神经干细胞的基因修饰； ３．神经干细胞移植，定向分化的分子机制。 －4－
2. 拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 研究方法： １．无血清培养，单细胞克隆技术； ２．mRNA差异消减显示技术； ３．原位杂交；RT-PCR，免疫组化技术，透射电镜技术； ４．基因转染技术。 技术路线： 建立HD动物模型 MSC的分离及体外培养 MSC向神经干细胞的转化 神经干细胞体外培养，克隆（V-MYC，EGF等多种基因转染，修饰） 神经干细胞移植到HD动物无神经节细胞段 诱导分化（维甲酸等） mRNA差异消减显示技术显示神经干细胞移植分化的分子机制 观察无神经节细胞段肠神经系统形态及功能 获得通过MSC、神经干细胞移植对先天性巨结肠症肠道神经组织重建的方法 －5-1－
实验方案： 第一部分：建立HD动物大鼠 参照文献进行大鼠选育，源于Wistar-Imamichi AR系，HD大鼠均结肠造瘘处理。 第二部分：MSC分离培养，向神经干细胞转化 1. MSC分离培养 切取鼠一侧股骨，暴露骨髓腔，用注射器抽取细胞培养液（DMEM/20?FBS），反复多次冲洗出骨髓细胞，用吸管反复抽吸后，Ficoll 分离液离心分离出有核细细胞，移入T-75培养瓶，过夜培养，第二日将悬浮细胞移去（贴壁细胞为较纯的基质干细胞），3-4天更换培养液，当细胞融合时用胰岛素/EDTA（trypsin/EDTA）处理，收获贴壁细胞为MSC ( MSC鉴定选用CD29，CD90，CD106等标记)。 2. MSC向神经干细胞转化 参照文献在MSC培养液中加入脊索中胚层浸出液，脊索中胚层条件培养液，星形胶质细胞上清液，多种神经生长因子等。 3. 鉴定 A. 光镜及电镜下观察转化细胞形态改变。 B. 免疫组化或流式细胞仪检测细胞转化后的表面标志: nestin, 波形蛋白，RC抗原。 第三部分：神经干细胞分离提取，体外培养，基因转染 1. 神经干细胞的分离和传代 分别取鼠纹状体和孕鼠皮层组织，吸管吹打机械分离制成单细胞悬液，利用DMEM/F12(1:1) 加B27及bFGF无血清培养基进行原代培养，具体参见文献。 2. 体外基因转染 对于以上两种来源的神经干细胞采用脂质体介导基因转染技术，将V-MYC，EGF，及FGF-2 ，PA，MMP cDNA重组逆转录病毒载体导入神经干细胞，包括双基因及单基因转染的多种形式。逆转录病毒载体pLNCXE由中国医学科学院分子生物学国家重点实验室提供。E. coli质粒DNA大量制备、纯化和酶切参照Sambrook等的文献方法进行；按LipofectamineTM试剂盒说明进行转染实验。 第四部分：神经干细胞在无神经节细胞段的移植，定向分化及检测 —5-2—
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