多孢木霉HZ-31菌株发酵条件研究
朱海霞，马永强，魏有海，郭青云
【摘 要】选用高效除草活性的生防菌株多孢木霉(Trichoderma polysporum)HZ-31菌株为对象，研究该菌株最适碳源、氮源、固态发酵基质的筛选、固-液发酵条件的优化。结果表明：HZ-31最适碳、氮源为小麦粉，最适氮源为(NH4)2SO4，在PDA培养基上产孢量达6.17×108 mL-1，最适碳氮源培养基上产孢量达到4.45×109 mL-1。HZ-31最佳产孢的固态基质为麦秆糠，适宜的接种量是体积分数为40%。正交优化培养试验条件得出该菌最适培养基质含水量为37%，最适温度为23 ℃，发酵最适时间为8 d。 【期刊名称】西北农业学报 【年(卷),期】2017(026)001 【总页数】5
【关键词】多孢木霉HZ-31；固态发酵基质；固-液发酵条件
菌株HZ-31分离于自然感病的大刺儿菜，由青海省农科院植保所有害生物综合防治实验室提供保存。前期研究结果显示，该菌株在PDA平板上培养7 d后，表面产生致密的白色分生孢子，分生孢子梗排列成半球形或垫状的疱状物，分生孢子梗有隔膜，通常高度分枝，以2～4个轮生，直角，分生孢子长椭圆形或球形，光滑，结合形态特征和分子鉴定结果，判断菌株HZ-31为多孢木霉(Trichoderma polysporum)。离体条件下测定其对禾本科杂草野燕麦种子萌发的影响，结果表明经该菌发酵滤液处理后，野燕麦种子发芽率为0，菌株对种子萌发抑制率达100%；喷施于盆栽野燕麦叶片后可导致叶片发黄枯萎甚至整株枯死，接种5 d后对野燕麦的发病率和病情指数分别达到90.0%和82.0。
同时，该菌株对藜、猪殃殃等农田阔叶杂草亦表现出不同程度的除草活性，且对青海省主栽作物小麦(Triticum aestivum L.)、蚕豆(Vicia faba L.)、豌豆(Pisum sativum L.)安全性评价结果表现为安全[1]。生防菌株HZ-31具有开发成为小麦、蚕豆、豌豆田真菌除草剂的潜力。
碳氮源、基质含水量、培养时间、培养温度等因素是发酵过程中重要的检测和控制参数，可直接影响到菌体生长和产物合成[2]。对菌株HZ-31的发酵生产工艺来说，明确各因素与菌株发酵生产之间的关系，将为该菌的规模化生产和剂型研究提供理论依据。因此，本研究运用单因素法确定生防菌株最适碳、氮源和固态发酵基质，正交试验开展最佳基质组合筛选和菌株培养条件的优化试验，明确固液发酵条件与菌株发酵生产之间的关系，为该菌的大规模生产提供必要的工艺参数，控制并改进发酵工艺条件，使其大量繁殖，为实现生物菌剂的产业化生产及进一步的推广应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
HZ-31多孢木霉(Trichoderma polysporum)分离于自然感病的大刺儿菜，由青海省农科院植保所有害生物综合防治实验室提供保存。 1.2 试验设计
1.2.1 最适碳、氮源的确定 以PDA培养基作为基础培养基进行碳氮源单因素试验，用等质量的玉米粉(C1)、小麦粉(C2)、蔗糖(C3)、葡萄糖(C4)作为碳源。氮源KNO3(N1)、大豆粉(N2)、酵母膏(N3)、(NH4)2SO4(N4)为氮源，按照质量分数为2%的添加量，将各碳氮源添加到基础培养基中，配制成不同的碳氮源培养基[2-4]，取经活化直径8 mm的菌饼作为接种体接入皿中。以不添加
碳氮源的基质作为对照，每处理重复3个。血球计数法统计产孢量，同时用分光光度计在600 nm波长内测孢子悬浮液OD吸光值，确定筛选效果[5]。 1.2.2 固态发酵基质筛选 选用菜籽饼、麦秆糠、羊粪、麦麸、珍珠岩和蛭石作为基质[4-5]。将不同基质500 g高温灭菌后放入白塑料盘中，接种菌液后20 ℃室内培养，观察记录菌落生长状况；用分光光度计测其OD吸光值，确定产孢量高的底物基质。每处理设3个重复。
1.2.3 最适接菌量的确定 以菜籽饼作为底物，混合营养物质加入150 mL三角瓶，每个处理加入无菌水20 mL，接基质体积分数的10%、20%、40%、60%、80%、100%比例将孢子悬浮液接入培养基中充分混匀培养，用血球计数板计数确定产孢量最高的接菌量。每个处理重复3个。
1.2.4 培养基含水量对产孢量影响 称25 g菜籽饼基质装入150 mL三角瓶，加入基础培养基营养物质混匀，按基质体积百分比分别加 10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%蒸馏水[6]，培养基灭菌后接种对应的菌株，在恒温培养箱25 ℃培养菌落，观察菌丝生长状况，第7天测孢子悬浮液的OD值，结合菌丝生长状况，得出适合该菌生长的培养基含水量范围。每个处理重复3个。
1.2.5 培养温度对产孢量的影响 称取25 g菜籽饼作为基质装入150 mL三角瓶，加入各菌对应的基础培养基 II营养物质混匀，按基质体积百分比加水40 mL，灭菌接入相应的菌种后，分别在恒温箱中以15、20、25、30、35 ℃恒温培养，7 d后测孢子悬浮液的OD值，结合菌丝生长状况，得出适合该菌生长的培养温度范围[3]。每个处理设3个重复。
1.2.6 二次正交旋转组合设计 通过单因素试验筛选出培养基含水量和培养温度，
多孢木霉HZ-31菌株发酵条件研究
