翻译Stober Synthesis of Monodispersed Luminescent Silica Nanoparticles for Bioanalytical Assays

Stober法合成作为生物分析的单分散荧光二氧化硅纳米微

粒

Stober Synthesis of Monodispersed Luminescent Silica

Nanoparticles for Bioanalytical Assays

Liane M. Rossi, Lifang Shi,Frank H. Quina, and Zeev Rosenzweig

化学系和先进材料研究所（AMRI），新奥尔良大学，新奥尔良，路易斯安那州70148,

及化学研究所，圣保罗大学，圣保罗，SP 05508-900 巴西

2005年2月15日收到，最后形态：2005年3月7日

我们发现一种简单的方法可制备出高产率的不同尺寸、粒度分布窄的发光、耐光的硅纳米微粒。该方法是基于使用Stober合成的荧光团形成了感光的二氧化硅纳米粒。不同于常用的制备发光硅微粒的微乳法，Stober法是在一种在室温下碱性乙醇、水混合条件下，可避免使用有毒的有机溶剂和表面活性剂。我们的发光颗粒包含着过渡金属化合物：三（1,10-菲咯啉）二氯化钌，[Ru(phen)3]Cl2。与Ru(phen)3溶液相比，它有较高的光稳定性和较长的荧光寿命。染料分子从硅球泄露是微不可计的，这归因于带正电的钌化合物和带负电的硅球之间强静电吸引力。为了证明高度发光的硅纳米球在生物分析中的适用，我们在其表面修饰抗生蛋白链菌素并将其结合在生物素化的载玻片上。实验数据显示，在涉及生物分析中模拟发光检测法中荧光纳米硅球有着吸引人的可供选择的检测技术。

简介

近年来发光纳米球被用于替代有机荧光团做为生物体系的光标记物。它相对

【1,2】其他染料有更多的优势。例如，由于发光分子在纳米球包裹内隔离了可使发

光猝灭的因素，如氧气和水，增加了耐光度和发射量子产率。

【3,4】

由于较易功能

化的粒子表面，硅纳米微球是一个非常有吸引力的本体，这使它可结合生物活性

【1-10】分子形成靶向目标。当有机荧光团与粒子共价，他们合成涉及染料的预先修

饰.【5，11】最近，Trau和他的同事采用Stober法合成了多孔化功能性二氧化硅微

【12】球。随着氨丙基三乙氧基硅烷加入与异硫氰酸修饰的染料偶联，荧光分子

逐渐被包含在微球内。然而，大多数染料分子在不影响他们的发光特性下不容易被修饰。有机荧光团能包裹在二氧化硅微球里，但这被证实是困难的，因为二氧化硅本体是高亲水性的而染料分子有相对较高的疏水性。

Stober合成是制备二氧化硅微球的广泛应用的方法。【13】这个简单的一步合成是正硅酸乙酯（TEOS）在乙醇-水碱性条件混合室温下缩聚而成。采

用Stober法可以得到优良的控制尺寸、窄的尺寸分布和平整的球面的二氧化硅微粒。我们的研究集中在用Stober制得中间密封着钌二亚胺配合物的二氧化硅纳米粒子及其在生物链霉亲和素的亲和力测定的应用。

实验方法

药品与试剂。三（1,10-菲咯啉）二氯化钌、TEOS、3-巯基丙基三甲氧硅烷（MPTMS）均购于Aldrich Chemicals公司。链霉亲和素-马来酰亚胺和生物素-马来酰亚胺购于Sigma。所有试剂都是用原样除非特别提到。去离子水至少有18MΩ?cm的特定电阻率，用来配置所有的磷酸缓冲溶液。

荧光硅球的制备：往5mL的TEOS-乙醇溶液添加含有氢氧化铵和三（1,10-菲咯啉）二氯化钌水溶液的25mL乙醇混合液。试剂的用量如表1。混合液搅拌一个小时后超声十分钟。 离心（5000rpm，10min）分离出荧光纳米粒再用乙醇洗涤三次。样品100℃减压干燥1小时。制备的产率大约为80%。

表1 制备荧光二氧化硅纳米微球各个药品量

修饰硫醇的的发光硅球的制备。2mg发光硅球超声溶解于10mL乙醇，加入100μL MPTMS，密闭搅拌过夜。离心分离（5000rpm，10min）出微球，乙醇洗涤三次。将微球分散在4mL pH7.4的磷酸缓冲液，4℃下保存。

修饰抗生蛋白链菌素的发光硅球的制备。pH7.4的5mL磷酸缓冲液中加入0.25mg马来酰亚胺标志的抗生蛋白链菌酶，与储存的1mL硫醇修饰的发光硅球混合，室温下缓慢搅拌2h。离心分离（5000rpm，10min），磷酸缓冲液洗涤三次后分散于4mL pH7.4的磷酸缓冲液，立即用于生物素链分析。

修饰生物素的玻片的制备。1M HNO3溶液洗涤显微镜玻片，分别在水和乙醇超声15min除去沉淀的有机物质。干燥的氮气吹干载玻片，室温下在5% MPTMS的甲苯溶液中放置4h。用甲苯、乙醇洗涤后通干燥的氮气吹干，100℃下16h。然后取0.5mg马来酰亚胺标志的生物素溶于10mL的pH7.4磷酸缓冲液，室温下

浸入已处理好的载玻片2h。用磷酸缓冲液洗涤此生物素标志的载玻片，用于生物素链分析。

连接修饰抗生蛋白链菌酶的发光硅球和修饰生物素的玻片。取100μL的浓度范围在0-200μg/mL的抗生蛋白链霉菌修饰的发光硅球溶液平铺在生物素修饰的载玻片上，等待30min后用水洗三次，用数码影像显微镜系统测量荧光颗粒附着在玻片上的点数。

荧光硅球的表征。JEOL-2010电子显微镜测微粒的透射电镜（TEM）图像，条件是200kV的加速电压。滴一滴微粒水溶液在铜载网作为TEM样品，在任意位置放大的图片可发现粒度分布大约在200粒。用石英比色皿在PTI主量子荧光分析仪扫描荧光发射，以75w的短弧氙灯做光源。爱丁堡分析仪LP900激光闪光系统用发射模式测量荧光寿命（监控灯快门关闭）。取3.00mL钌染料溶液或3.00mL钌掺杂的荧光微粒悬浮液置于1cm的石英荧光比色皿。激发光为Surelite I-10 Nd:YAG 激光器发射出的第三谐波（355nm）。必要时通氮气冒泡去养。测量时持续搅拌样品，用常见的紫外-可见吸收光谱（惠普84452A二极管阵列分光计）检测激光分解。进行10次激光扫描平均出其590nm的发射衰减曲线，分析常规标准指数衰减是采用LP900爱丁堡分析仪器系统软件获得受激发物质的寿命。

图1. [Ru(phen)3]Cl2掺杂的440±18nm的硅球的TEM图像（左）和数字荧光图像（右），其为40倍显微目镜、用激发滤波器通带为460±10nm的、505nm分色镜、515nm的长通发射滤波器得到。

数字荧光成像显微镜系统。采用倒转的荧光显微镜（Olympus IX70）、100w汞灯作为光源的数字荧光成像显微镜系统获得荧光微粒与生物链霉亲和素修饰的载玻片相互作用得到的荧光影像。荧光影像收集是用激发滤波器通带为460±