人类尿液来源干细胞的体外培养和生物学特性分析

人类尿液来源干细胞的体外培养和生物学特性分析

牛鑫1，张国威2，汪泱1

【摘 要】摘要:目的 从人类尿液中直接分离能够体外大量扩增且具有多向分化潜能的干细胞，并研究其生物学特性。方法 收集志愿者尿液100～200ml，经离心后使用完全培养基重悬，接种于培养板中；克隆贴壁生长后换液。大量扩增后通过流式细胞术检测其表面标志物，使用成骨、成软骨诱导培养基对其进行诱导分化，通过茜素红染色、阿利新蓝染色检测诱导分化结果。结果 每100m l尿液经14d培养能够直接分离得到3～10个克隆，传代培养至第5代时可扩增至2～10×107个尿液来源干细胞，能够满足细胞治疗需要。尿液来源干细胞表面标志物CD29，CD44，CD73，CD90为阳性，CD34，CD45，HLA-DR为阴性，与间充质干细胞一致。经诱导培养后，尿液干细胞能够能够成骨、成软骨分化。结论 尿液来源干细胞具有间充质干细胞特性，可以作为细胞治疗、组织工程中的种子细胞。 【期刊名称】实验与检验医学 【年(卷),期】2017(035)005 【总页数】4

【关键词】尿液来源干细胞；间充质干细胞；种子细胞 【文献来源】

https://www.zhangqiaokeyan.com/academic-journal-cn_experimental-laboratory-

medicine_thesis/0201224636334.html

·论 著·

细胞治疗是攻克危重疾病、修复难愈合损伤的新型疗法。干细胞因其增殖能力旺盛，具有多向分化潜能、能够分泌多种因子等生物学特性通常被选为细胞治

疗的种子细胞。种子细胞的来源和培养是长期以来限制细胞治疗发展的关键因素。目前，可用于细胞移植疗法的种子细胞主要为胚胎干细胞、诱导多能性干细胞和骨髓、脂肪等多种组织来源的间充质干细胞 （mesenchymal stem cells，MSCs）。胚胎干细胞来源有限，培养方法复杂，面临伦理、成瘤问题以及异体移植的免疫排斥风险[1]；诱导多能性干细胞诱导、培养过程复杂，且有成瘤风险；骨髓、脂肪来源的间充质干细胞因其可以自体取材、成瘤风险低、且免疫排斥风险低，在细胞治疗中具有一定优势，并被广泛研究。例如，经研究证实，骨髓来源间充质干细胞能够在体外直接分化为神经元[2]；在体内实验中，骨髓来源间充质干细胞能够迁移至缺血半影区[3]。此外，骨髓来源间充质干细胞还能够促进血管生成 [4，5]，抑制凋亡[6]，分泌营养因子[7]。将骨髓来源间充质干细胞自体移植，能够显著促进糖尿病足坏死创面的愈合[8]。但是，骨髓、脂肪来源间充质干细胞取材过程有创，给病人造成额外痛苦和负担。因此，寻找来源无创的移植种子细胞一直是干细胞研究领域持续关注的热点问题。 尿液能够作为检测、诊断多种疾病的生物样本，蕴含丰富的代谢产物、生物大分子、囊泡、细胞等内容物[9-12]，并且能够无创、大量获取。鉴于此，我们尝试从尿液中获取干细胞。经过摸索，我们建立了从尿液中直接分离培养干细胞，即尿液来源干细胞（urine-derived stem cell，USCs）的新体系。 我们利用特性成分培养基，通过简单离心，从人体尿液中分离得到一种干细胞，其可表达CD44、CD73、CD90、CD29等标志物，并具有多向分化潜能。尿液干细胞获取过程无创，获取过程简单，且能够多次无限量获取，从而为干细胞的研究和利用增加了一个极其安全、便利的细胞来源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 尿液由成年健康志愿者捐赠捐赠过程符合上海市第六人民医院伦理委员会各项规定。捐赠者留取清洁中段尿液100～200ml，以备使用。

1.1.2 主要仪器生物安全柜 （Thermo），CO2培养箱（Thermo），离心机。 1.1.3 主要试剂100×antibiotic antimycotic（GIBCO，15240062），尿液干细胞完全培养基（DMEM/F12 培养基（Corning），优级胎牛血清（GIBCO）2%，EGF （Perprotech）10ng/ml，PDGF （Millipore）2ng/ml，TGF-beta（Perprotech）1ng/ml，bFGF （Perprotech）2ng/ml，氢化可的松（Sigma）0.5mM，胰岛素（GIBCO）25mg/ml，转铁蛋白（sigma）20mg/ml，肾上腺素549ng/mL，三碘甲状腺氨酸 125ng/ml），0.25%胰蛋白酶（含 EDTA）（GIBCO）， 磷酸缓冲液（PBS）（Corning），明胶（上海国药集团），多聚甲醛（上海国药集团），成骨诱导培养基（GIBCO），成软骨诱导培养基（GIBCO），茜素红（Sigma），阿利新蓝（Sigma）。 直 标 抗 体 ：CD34-APC(BD No.560940)，CD45-FITC(BD No.560976)，CD29-PE(BD No.561795)，CD44-FITC(BD No.560977)，CD73-PE(BD No.561014)，CD90-PE(BD No.560970)，HLA-DRPE(BD No.560943)。 1.2 方法

1.2.1 细胞分离将0.1%明胶按1.5ml/孔加入6孔板，置于CO2培养箱中，在37℃下静置2h完成包被。细胞接种前弃去明胶。取尿液样本后，按每100ml尿液加入 5ml 100×antibiotic antimycotic，充分轻柔混匀，400g离心10min；弃上清，使用PBS清洗沉淀物，然后再次400g离心10min。离心后弃去上清，每100ml尿液的沉淀物使用6ml尿液干细胞完全培养基重悬，并