目录
1 材料与方法.....................................................................................................................................1
1.1 菌株的保存与培养..............................................................................................................1 1.2 蛋白可行性分析 ..................................................................................................................1 1.3 载体构建 ..............................................................................................................................2 1.4 大肠杆菌TOP10感受态的制备与转化 ............................................................................2 1.5 毕赤酵母GS115感受态的制备与转化 .............................................................................3 1.6 蛋白表达、纯化与鉴定 ......................................................................................................4
2 结果与分析.....................................................................................................................................4
2.1 蛋白可行性分析 ..................................................................................................................4 2.2 蛋白表达鉴定 ......................................................................................................................5
1．材料与方法
1.1.1 菌株的保存与培养
大肠杆菌（Eschrichia coli）菌株TOP10于LB培养液摇菌后保存成20%的甘油菌于
-80℃冷冻保存。毕赤酵母（Pichia pastoris）菌株GS115于YPD培养液摇菌后保存成30%的甘油菌于-80℃冷冻保存。大肠杆菌于37℃培养箱中培养。毕赤酵母于28℃培养箱中培养
1.1.2 试剂的配置
LB培养基 蛋白胨 NaCl
10 g/L 10 g/L 5 g/L
酵母提取物
加水溶解，调节pH至7.0，定容至1 L，固体培养基加入20 g/L琼脂，121℃灭菌20 min。
TB buffer PIPES
2 ml（0.5 M，pH6.7） 0.22 g 1.866 g 1.088 g
CaCl2·H2O KCl
MnCl2·4H2O
加水溶解，定容至100 ml，用0.22 μm过滤器过滤灭菌。
YPG培养基 酵母提取物 蛋白胨 甘油
BMMY培养基 酵母提取物 蛋白胨
10×YNB 10×PBS
5 g/L 10 g/L 1× 1×
5 g/L 10 g/L
1.2 蛋白可行性分析
信号肽预测使用SignalP 4.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）和SignalP 5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）。
N糖基化预测使用NetNGlyc 1.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）。 蛋白质三维结构预测使用SWISS MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）。 1.3 载体构建 1.3.1 目的基因的克隆
1）基因X由客户提供。
1.3.2 重组质粒
1） 所用载体为LDF，酶切位点为XhoI和PstI；
图1 载体图谱
LDF载体图谱。
1.4 大肠杆菌TOP10感受态的制备与转化 1.4.1 大肠杆菌感受态的制备
1） 从甘油菌中活化TOP10，37℃培养（尽量划出单菌落）；
2） 挑单菌落摇菌（LB液，MgSO4 20 mM（终浓度）），37℃ 200 rpm过夜； 3） 按1：50或1：100扩培到100 ml LB液体培养基中（MgSO4 20 mM（终浓度）），22℃ 200 rpm 4 h左右；
4） 待0D600= 0.2-0.3时，置于冰上10min； 5） 4℃ 3000 rpm离心10 min收集菌体，弃上清；
6） 15 ml TB Buffer悬浮，冰上放置10 min（TB Buffer预先于冰上预冷）； 7） 4℃ 3000 rpm离心10 min收集菌体，弃上清； 8） 用10 ml感受态液体悬浮（0.6 ml DMSO+7.4 ml TB）；
9） 按100 μl/管分装至1.5 ml EP管中，冰上操作，分装后迅速放于-70℃保存。 1.4.2 大肠杆菌感受态的转化
1） 吸取10 μl重组质粒到感受态细胞中，冰上放置30 min； 2） 42℃热激90 s，冰上放置5 min；
3） 于超净台中加入800 μl LB液体培养基，37℃ 220 rpm复苏1 h；
4） 4000 rpm离心5 min，保留100 μl LB悬浮菌体，涂布于相应抗生素的LB固体平板上，37℃过夜培养；
1.5 毕赤酵母GS115感受态的制备与转化 1.5.1 毕赤酵母电转感受态的制备
1） 从新鲜划线培养的P.pastoris GS115平板上接单菌落，转移至50 ml液体YPG培养基中，30℃ 200 rpm培养至OD600=1.0-1.5之间。
2） 4000 rpm离心5 min收集菌体，用10 ml酵母感受态母液重悬，室温静置30 min，每隔10 min轻柔颠倒混匀。4000 rpm离心5 min收集菌体。
3） 用10 ml预冷的1 M山梨醇重悬，然后4℃ 4000 rpm离心5 min，收集菌体。 4）重复上述步骤3次。
5）最后用200 μl预冷的1 M山梨醇重悬，分装至1.5 ml离心管中，每管80 μl，可直接使用或保存于-80℃。
酵母感受态母液：10 mM Tris-HCl，0.6 M山梨醇，10 mM DTT，100 mM LiAc，pH7.5.过滤除菌。
1.5.2 毕赤酵母感受态电击转化
1） 冰浴预冷0.2 cm电击杯，打开电击仪，调整电转参数：电压1.5 kV，电阻250 Ω，
电容25 μF。
2） 向制备好的酵母感受态细胞中加入2-5 μg DNA片段，轻柔吸打混匀后转移至电
击杯中，冰浴5 min。
3） 进行电转操作，电击结束后立刻向电击杯中加入1 ml预冷的1 M山梨醇，并吸
打混匀，然后转移至1.5 ml离心管中，于30℃培养箱中静置培养1 h。
4）室温下4000 rpm离心4 min，收集菌体，并用100 μl YPG重悬。
5）将细胞悬浮液涂布在含有100 μg/ml Zeocin的YPG平板上，30℃下培养3-5天。
1.6 蛋白表达、纯化与鉴定 1.6.1 蛋白诱导表达
1） 接种多个酵母单菌落于20 ml YPG中，30℃ 220 rpm培养2 d至菌液饱和。 2） 4000 rpm离心5 min，收集菌体，用20 ml BMMY重悬。
3） 加入0.75%（即150 μl）甲醇诱导表达，之后每隔24 h补加一次甲醇，一共需要加5次。25℃ 220 rpm诱导表达。
4） 第6天，室温4000 rpm离心5min收集上清，即为酵母外泌表达蛋白； 5） 分别进行考染与WB检测蛋白表达情况。 1.6.2 His标签纯化
1） 事先装好Ni-NTA beads重力柱（30 ml柱体积，包含5 ml Ni-NTA beads）； 2） 打开塞子，让保护液流出，加入5 ml Lysis buffer清洗柱子，共洗3遍； 3） 加入20 ml上述诱导表达的蛋白，使蛋白按一定流速从下口流出； 4） 加入20 ml Wash buffer清洗，共洗6遍； 5） 加入2 ml Elution buffer洗脱蛋白，收集洗脱液。
6） 把洗脱液再加回柱子中，进行二次洗脱，重复3次，以彻底洗脱柱子上的蛋白并提高洗脱效率。 1.6.3 蛋白鉴定 1.6.3.1 WB检测
1） 取20 ?l蛋白溶液进行蛋白质电泳，先80 V跑出积层胶，后100 V至电泳结束； 2） 转膜，100 V 90 min；
3） 转膜结束后将膜用TBST洗1次，10 min，倒掉TBST； 4） 用含5%脱脂奶粉的TBST封闭，室温下低速摇床上封闭1 h； 5） 用含5%脱脂奶粉的封闭液稀释一抗，膜室温下低速摇床上杂交4 h； 6） TBST洗膜3次，每次10 min：
7） 用含5%脱脂奶粉的封闭液稀释二抗，膜室温下低速摇床上杂交45 min； 8） ECL曝光后上机扫膜。
2．结果与分析
2.1 蛋白可行性分析
为了初步分析所选蛋白是否可用于酵母外泌系统表达，我们通过信号肽预测、N糖基
化预测和三维结构预测，发现X基因都不含有信号肽，并且C端是裸露的，所以打算把His标签添加至C端。无糖基化位点，三维结构为单体（表1）
表1 四个蛋白可行性分析
基因名称 氨基酸蛋白预测同源性单体/末端暴5.0信4.0信糖基化 数量 名称 分数 聚体 露 号肽 号肽 位点数量 X --aa 类甜蛋白 65.5% 单体 C端暴无信号无信号0 露 肽 肽 2.2 蛋白表达鉴定
为了确定蛋白是否表达，进行WB检测。结果如图1所示。
图1 WB检测
WB检测蛋白表达情况，M：Maker; 1: X第四次加甲醇；2:第五次加甲醇; 3:His对照。
结论：X蛋白可以表达。
酵母蛋白外泌表达报告模板
