自动生化分析仪实际K值测定
实际K值：理论K值受样品和试剂的加量准确度、比色杯光径准确度，尤其是ε的影响。ε在波长和温度等不同时有所不同，故有必要获得用户所用分析仪的实际ε，再计算K值，此为~。
一、340nm波长实际K值测定 【实验原理】：通过有NAD+（NADP+）参与的反应途径，用NADH或NADPH标准液来校正仪器。用己糖激酶（HK）方法测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与NADH的生成呈等摩尔关系。葡萄糖有标准纯品，当反应达到终点时，NADH的摩尔数等于标准的葡萄糖摩尔数。在需要校正的仪器上测其A即可求得实际摩尔吸光系数，计算出实际K值。 【注意事项】
1．减少偶然误差 重复测定10次，当CV>5％时，则重新测定10次。 2．减少系统误差 使用实际K值计算酶活性。
3．如果实际ε值与理论ε值偏差过大，需对仪器检修和校正。 二、405nm波长实际K值测定 【实验原理】：许多酶活性测定时，以人工“色素原”为底物，经酶作用后可释放出在405nm波长具有吸收峰有色的反应产物，如对硝基苯酚(4-NP)、对硝基苯胺(4-NA)、对硝基-5-氨基苯甲酸(ANBA)。他们在405nm波长时的理论ε分别为18 700、9 870、9 490。可使用其相应的纯标准品在需要校正的仪器上测其A即可求得实际ε，计算出实际K值。以ALP实验 (产物为4-NP) 为例测定实际K值。 【注意事项】
1．4-NP标准品纯度要求较高，必要时需纯化。 2．其他注意事项参见340nm K值校正。 三、如何校正K值
在理论K值或实际K值得情况下，测定某标准品的含量，若测得的结果偏低，则需要把测得的结果调整至原标准品的含量，此时调整的数值称为校正因子，则校正K值=理论（实际）K值 × 校正因子=理论（实际）K值 × 校准值 ÷ 实测值
NADH正负向反应测定酶活性 一、血清乳酸脱氢酶测定
LD催化反应式为：L-乳酸 + NAD+（LD）→ 丙酮酸 + NADH + H+
在反应过程中，乳酸被氧化生成丙酮酸，同时NAD+还原为NADH。因NADH在340nm处有吸收峰，反应会引起340nm吸光度的增高。吸光度增加的速率与样本中LD活性呈正比关系。NADH正向反应的最适pH偏碱性，可使反应平衡偏向产生丙酮酸的方向。 【参考范围】成人血清LD ：109 U/L ~245 U/L 【临床意义】
1. LD活性增高：目前临床测定LD活性常用于心肌梗塞、肝病和恶性肿瘤的辅助诊断。 2. LD活性降低：目前没有发现重要的临床意义。
3. LD的特异性差，几乎存在各种组织中，如：心、肺、肾、肝、骨骼肌以及恶心肿瘤等疾患时均致此酶增高。 【注意事项】
1. LD活性测定可用抗凝血浆，肝素的影响不大， 而草酸盐抗凝剂、EDTA都是LD的竞争性抑制剂，能抑制LD活性。
2. 不同的LD同工酶对温度的敏感性有差异。组织提取液若放于-20℃过夜，LD4和LD5会丧失全部的 活性。
3. 严禁使用溶血标本，红细胞、血小板中含有大量的LD。 4. 比色应在5~15min内完成，否则吸光值会降低。 【评价】
LD能可逆地催化乳酸（lactate, L）和丙酮酸（pyruvate, P）之间的氧化还原反应。 1. 正向反应最适pH是8.8~9.8，能使平衡偏向生成丙酮酸的方向。 其优点是乳酸和NAD+稳定性好。且NAD+纯品价格较低，过量乳酸对LD活性的抑制较小，反应线性较宽,重复性较好，特异性高。
缺点是需要较高的底物浓度，反应速度较慢。
2. 逆向反应的最适pH为7.4~7.8，与生理性pH相同。 其显著的优点是NADH用量少，仅为正向反应的3%，且反应速度比正向快3倍，灵敏度高。 缺点是但丙酮酸与 NADH的稳定性较差，过量的丙酮酸对LD活性的抑制作用较大。 二、连续监测法测定血清ALT 【实验原理】
L-丙氨酸 + α-酮戊二酸 （ALT） → α-丙酮酸 + L-谷氨酸 α-丙酮酸 + NADH （LD）→ 乳酸 + NAD+
在340nm处连续监测到NADH的消耗量，从而计算出ALT活性浓度。
在双试剂测定中，首先使血清与缺少α-酮戊二酸的底物溶液混合，37℃保温5min，将样品中所含的α-酮酸（如丙酮酸）消耗完，然后加入α-酮戊二酸启动ALT催化的反应，在波长340nm处连续监测吸光度下降速率。 【参考范围】：成人血清ALT 5U/L～40U/L。 【临床意义】
1．ALT是肝细胞损伤的诊断指标
①急性肝细胞损伤的灵敏指标。②慢性活动性肝炎或脂肪肝时，转氨酶轻度增高（100U～200U），或在正常范围，且AST＞ALT。③肝硬化、肝癌时，ALT有轻度或中度增高，提示可能并发肝细胞坏死，预后严重。④其它原因引起的肝脏损害，如心功能不全时，肝淤血导致肝小叶中央带细胞的萎缩或坏死，可使ALT、AST明显升高。⑤某些化学药物如异菸肼、氯丙嗪、苯巴比妥、四氯化碳、砷剂等可不同程度地损害肝细胞，引起ALT的升高。 2．其他疾病或因素亦会引起ALT不同程度的增高。如骨骼肌损伤、多发性肌炎等亦可引起转氨酶升高。
3．ALT活性降低见于磷酸吡哆醛缺乏症。 【注意事项】
1．试剂空白测定值以蒸馏水代替血清，测定ALT活性单位，规定测定值应小于5U/L. 2．血清不宜反复冰冻保存，以免影响酶活性。 3．ALT测定中存在着两个副反应。
4．在AACC(美国临床化学学会)或IFCC(国际临床 化学学会)推荐的试剂盒中，含有磷酸吡哆醛(P- 5'-P)。国家卫生部临床检验中心的推荐方法试剂中不加P-5'-P。
5．NADH在Tris缓冲液中稳定性较高；P-5'-P在Tris缓冲液中能显示有效的激活作用；磷酸盐缓冲液有延缓与脱辅基酶蛋白的结合作用。 【评价】
本法由于测定上限在酶促反应的线性范围内，偏差小，准确性好；测定条件较赖氏法易于控制，CV值比赖氏法小，精确性好；标本测定中不需要标准对照，测定结果计算方便，操作简便。
但实验条件要求严格，成本高。
色素原底物反应测定酶活性 色素原：一些水解酶类或转移酶类经过酶促反应将化合物中的某一基团水解或移除，使无颜色的底物转变为有颜色的产物，这类底物称为色素原底物。 一、血清碱性磷酸酶（ALP）测定 【实验原理】：波长：405±1nm
磷酸对硝基苯酚二钠（4-NPP）+ H2O （ALP，pH 8.6~10）→ 磷酸 + 对硝基苯酚（4-NP，黄色）
【参考范围】成人血清ALP： 40 U/L ~150 U/L 【临床意义】
1. ALP可作为肝胆和骨骼疾病的辅助诊断指标。肝胆疾病，如阻塞性黄疸、急或慢性黄疸型肝炎、肝癌等血清酶活力可增高。发生骨骼疾病时，由于骨的损伤或疾病使成骨细 胞所含高浓度的ALP释放入血，引起血中ALP活力增高。
2. ALP减少比较少见，主要见于呆小病、成骨不全症、磷酸酶过少症、维生素C缺乏症等。 【注意事项】
1. 血清置室温（25℃），ALP活性显示轻度升高。 例如，室温6小时，酶活性约增高1%，置1~4天酶活性增高3%~6%。血清存放冰箱（4℃），酶 活性也出现缓慢升高。冰冻血清，ALP活性降低，但当血清复温后，酶活性会慢慢恢复。 2. 本法的线性范围：0~500 U/L（37℃）。
代谢物酶试剂法
是以酶为试剂测定酶促反应的底物及其相关物质的一类方法。
根据测定原理，这类方法的具体应用中又可分为“代谢物酶试剂终点法测定”和“代谢物酶试剂速率法测定”两大类 一、速率法测定血清尿素 【实验原理】
尿素 + H2O（尿素酶）→ 2NH3 + CO2
NH3 + α-酮戊二酸 +NADH + H+（GLDH）→ 谷氨酸 + H2O + NAD+
NADH在340nm波长处有吸收峰，其吸光度下降的速率与待测样品中尿素的含量成正比。 【参考范围】：血清尿素: 1.78 mmol/L～7.14 mmol/L。 【注意事项】
1．在340nm试剂空白对水的吸光度应大于1.00A，试剂浑浊或吸光度低于1.00A的应放弃使用。
2．测定过程中，各种器材和去离子水均应无氨离子污染，防止交叉污染，否则结果偏高。 3．血液标本最好用血清，含NaF的血浆可导致结果偏低。 4．在内源性氨正常时，本法能用于测定尿中的尿素。 【评价】
1．直接法：用二乙酰一肟与尿素直接作用，产生颜色反应。该法试剂单一，方法简便，但试剂具毒性和腐蚀性。更重要的问题是红色产物对光敏感，易褪色，目前多用氨基硫脲、铁离子、镉离子等物质来提高和稳定产物颜色。
2．间接法：用脲酶使尿素水解产生氨，然后测定氨的产量再换算成尿素含量。根据测氨量的不同方法，酶法又可分为：尿素酶Berthelot显色法、尿素酶/GLDH偶联法和尿素酶电极法。酶法的优点是无毒性、特异性高，适合于自动化分析仪的应用，使用越来越厂泛。 二、酶偶联终点法测定血清HDL及其亚类胆固醇
【实验原理】pH6.5的条件下，10% PEG20 000可将含apoB的脂蛋白沉淀，离心后的上清
临床意义与LDL-C基本相同。此外，临床上常将ApoAⅠ/ApoB100﹤1.0作为冠心病的危险指标。
【注意事项】
1．标本应是及时分离的空腹血清。
2．抗血清中不含杂抗体，效价不低于1∶16。 3．应注意抗原和抗体的比例。
4．比浊法测定（终点法）中宜选用多点定标，按曲线回归方程计算结果。 5．免疫比浊法的干扰主要来自血清，手工单一试剂法应设标本空白管。 6．应用定值血清作校准物以减少基质效应的影响。 【评价】：免疫浊度法为临床实验室测定ApoAⅠ和ApoB100的常规方法。其又分为免疫透射比浊法和免疫散射比浊法。免疫透射比浊法是目前实验室最常用的方法，该法操作简单，结果准确，可在自动生化分析仪上作批量测定。但该法对抗体的质量要求高，消耗抗体较多。
琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶 【实验原理】
乳酸脱氢酶同工酶的一级结构和等电点不同，在一定的电泳条件下，使其在支持介质上分离。然后利用酶的催化反应进行显色：
L-乳酸 + NAD+（LD，pH 8.8~9.8）→ 丙酮酸 + NADH + H+ NADH + H+ 2PMS → 2PMSH +NAD+ 2PMSH + INT → 2PMS + INTH + H+ 【操作步骤】
1、样本制备：取小鼠一侧肾脏，用0.9%生理盐水洗涤干净，加入1ml生理盐水于匀浆器中末5min。将匀浆液移入Ep管中2000rpm离心5min（实际上这个时间和转速都不够），取上清作为样品。
2、制备琼脂糖凝胶玻片：琼脂糖微波炉中加热至沸腾，吸管吸取融化的凝胶液2ml，均匀铺在玻片上。冷却凝固后，于一端约1~1.5cm处制槽。用0.5cm滤纸条，吸去琼脂中水分，形成加样槽。
3、加样：剪长约1cm，宽约0.2~0.3cm的滤纸，浸入样本液中完全湿润，置于加样槽中央。跑电泳前将滤纸揭去。
4、电泳：恒压70V跑1h，样本由负极向正极泳动。
5、显色：用显色液覆盖整个玻片，置于托盘中37°避光孵育10min。 6、双蒸水漂洗后观察结果，光密度扫描。 【参考范围】
健康成年人血清中LD同工酶百分比有下述规律：LD2＞LD1＞LD3＞LD4＞LD5。 【临床意义】
1. LD同工酶电泳分析在临床上常用于急性心肌梗死的诊断，在急性心肌梗死时LD1与LD2活性均升高，但LD1升高更早、更明显，导致LD1/LD2比值增大。
2. 溶血性疾病、幼红细胞贫血症、肾坏死、以及假性肥大性肌营养不良、活动性风湿性心肌炎、急性病毒性心肌炎患者血清LD1和LD2的活性也可增高。
3. 肝炎、急性肝细胞损伤时LD5增高。急性肺损伤、白血病、胶原病、心包炎以及病毒感染时LD2和LD3增高。
4. 胃癌、结肠癌和胰腺癌患者血清中五种LD同工酶均可升高，但以LD3增高最为显著。骨骼肌损伤时LD4和LD5增高。
检验医学专业实验IV 临床生物化学检验部分(同名44567)
