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JModem Stomatol，May 2008, Vol 22,No. 3
乳铁蛋白抑制舌癌细胞血管内皮生长因子表达的研究
王雷高文信陈英新
lactoferrin)对舌癌细胞株Tca8113细胞血管内皮生长因子
（vascular endothelial growth factor, VEGF)表达调控的情况。方法 采用四甲基氮唑蓝实猃（MTT)、RT - PCR法检测乳铁蛋白对 Tca8113细胞的增殖作用及VEGFmRNA表达改变的情况。结果 乳铁蛋白显著抑制Tca8113细胞的增殖，呈剂量依賴性，乳铁蛋白对Tca8113细胞VEGF的RT-PCR产物试验组(2和3)与对照组之间比较，差异具有统计学意义（尸 <0.05)。结论乳铁蛋白对Tca8113细胞的增殖有抑制作用，可以降低细胞中VECFmRNA的表达水平，为乳铁 蛋白用于肿瘤的
【摘要】目的探讨乳铁蛋白（預防及治疗提供实验基础。
【关键词】乳铁蛋白
血管内皮生长因子口腔肿瘤
Inhibitory effect of lactoferrin on vascular endothelial growth factor expression In Tca8113 cell WANG Leit GAO Wenxint CHEN Yingxiru College of Stomatology, Jilin University t Changchun 130041
【Abstract] Objective To investigate the effect of lactoferrin on vascular endothelial growth factor expression. Methods MTT assay was used to evaluate the growth effect of lactoferrin on Tca8113 cells. At the same time, the gene expression of VECF was examined by RT - PCR. Results Lactofenin could significantly inhibite the proliferation of Tca8113 cells in a dose dependent manner. The expression of VEGF gene in Tca8113 cells decreased significantly when compared with the control group( P <0.05). Conclusion Lactoferrin can not only inhibit Tca8113 cell growth, but also down - regulate the expression of VECF in Tca8113 cell.
【Keywords】 Lactoferrin Vascular endothelial growth factor Oral cancer
中图分类号：
R739.8
文献标识码
:A
白 (lactotransferrin),存在于多种组织中，具有多种多 样的生物学功能。在各种体液或分泌物中以乳汁特 別是初乳中乳铁蛋白含量最高，在哺乳动物的很 多外分泌物中，如眼泪、唾液和精液等也存在较低浓度的乳铁蛋白。乳铁蛋白具有广谱抗菌作用、抗病毒作用、抗氧化作用、抗癌作用、可以调节机体免疫反应。
研究证明乳铁蛋白对癌细胞有明显的抑制作用，乳铁蛋白对消化道肿瘤，如结肠癌、胃癌、肝癌、 胰腺癌，具有化学预防作用，并可抑制由此引发的肿瘤转移。我们探讨乳铁蛋白对舌癌
对肿瘤细胞血管生成的影响。
资料和方法
乳铁蛋白（lactoferrin, LF)亦称乳转铁蛋
作者单位:130041长春，杏林大学口腔医学院
通讯作名:高文信E - mail: wlandni? yahoo.com.
PBS中，储存浓度5mg/ml，-20℃
储存备用。 噻唑蓝（MTT)购自SIGMA公司。细胞培养基 DMEM购于GIBIC0公司。
2. 细胞培养:Tca8113口腔舌癌细胞系购于上海细胞研究所，用10%胎牛血清的DMEM培养基,5% CO,37℃
溶于
2
cn
培养、传代。
3. MTT法检测细胞增殖：Tca8113细胞接种于 96孔细胞培养板,细胞数5X 104/孔,用不同浓度的 乳铁蛋白（1.5、3、6、12、25、50μg/ml)处理Tca8113 细胞24小时，每组细胞设3个平行孔，阴性对照组培养瓶中加入
Tca8ll3细胞的 生长抑制作用,及其
I
主要试剂与来源：重组人乳铁蛋白
DMSO,空白对照组不加乳铁蛋白和DMS0。加入MTT,继续培养4h，A570mn测定吸光度,在酶联免
疫监测仪上测定各孔光吸收值。
蛋白处理24小时后PBS漂洗，倾去上层悬浮死细胞后加入新鲜培养基。另备一瓶细胞未用任何药物处理，将其
4. 细胞形态变化正常细胞，鳞癌细胞经各浓度的乳铁
(recombinant human lactoferrin〉
购于
SIGMA 公司，
基金项目 :国家\十五\科技攻关资助项目（2004BA720A28）；杏 林省科技发展计划项目（20010591 -2)
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倒置显微镜下，观察
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用做对照细胞。将培养瓶置于
5 ?
CK
乳铁蛋白干预前后鳞癌细胞的 不同形态。
RT-PCR 检测 Tca8113 细胞
VEGFmRNA 表 达：VEGF 上游引物：5、-ACATCTTCCAGGAGT - ACCCTGATGAG - 3 下游引物：5'- GCATTCACA -
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TTTGTTGTGGTGT – 3’； β- actin 的
上游
游引
引物
物:5
’：
5’ GTCG-
ACACTGTGCCCATCTACG – 3‘ 下TCATACTCCTGCTTG 3、Tca8113细胞接种于 24孔 细胞培养板,细胞奴2X 10sTca/孔，用不同浓度的乳铁 蛋白（12、6、3μg/ml)处理8113细胞24小时，每组细胞设promega3个平行孔，培养板内细狍采用Trizols提取总RNA( ,按说明书操作），用于RT - PCR 检测VEGFmRNA的表达。采用二步法RT - PCR, 细胞分试验组和对照组.1%琼脂糖凝smartview胶电泳显示 PCR产物.图像分析仪（)分析条带，用目的基因条带与β-actin
基因条带的密度比值汁算表达强度。
5. 统计学处理:采用T结检验作为显著性检验分 果
析。
1. 乳铁蛋白对MTTTca8113细胞增殖的抑制作用: 采用
法检测不同剂量重组人乳铁蛋白对 Tca8113细胞的抑钊效应，结果显示加入1.5、3、6、12、
25、50μg/
ml
重组人乳铁蛋白处理组的抑制率分 别为
16%、28%、30%、36%、43%、56%，其中加人 3、6、12、25、50Pμg/ml乳铁蛋白组与单纯细胞培养组比较差异有著性（ <0.05),
且随乳铁蛋白浓度增加，抑制作用逐渐增强。
2. 细胞形态学观察:镜下可见鱗癌细胞胞质丰富呈多角形。癌细胞密集成片生长，嵌合如铺路石。 乳铁蛋白干预后细胞正常形态发生明显的改变，细胞从正常的增殖旺盛的贴壁生长.随乳铁蛋白浓度 增加，细胞的粘附力降低，失去贴壁性，伪足消失，细胞变圆，生长缓慢.分裂相减少或消失，胞质粗糙，内有颗粒堆积,并可见细胞明显固缩，形态完整性遭到破坏（图1、2)。
3.
RTPCR - PCR检测结果:逆转录-聚合酶链式反应（RT-VEGFmRNA)的结果表明重组人乳铁蛋白可以调节舌癌细胞的表达，并呈剂量依赖性 (图3),乳铁蛋白浓度增加，VECF表达减少（图4) c 实验组2和3与对照组间比较，P <0.05,差异有统计学意义。
讨 论
在抑制肿瘤发生、发展方面，用自然存在的复合 物例如乳铁蛋白作为化学预防和化学疗法的方法已m 逐渐成为
要的治疗战略。乳铁蛋甶诱导细胞生长 抑制的分子
机制还不是十分淸楚。在口晬肿瘤中. 为了更好的研究乳铁蛋白介导的抗肿瘤活性的可能机制VEGFmRNA.我们观察了乳铁蛋白对舌癌细胞表达的调控作用。
肿瘤的形成及发展大体可分为两个阶段，即肿 瘤细胞的克隆性增殖阶段及继之的血管形成支持肿 瘤持续生长阶段。目前研究已证明肿瘤的生长依赖 于血管生成，血管内皮细胞生长因子（VEGF)是诚 为重要的血管形成因子,作用于血伢内皮细胞，可促 使其分裂、增殖，具有
丝裂原活性，并能诱发血管形 成，在肿瘤的发生中起着重要作用。我们先前的研VEGF 究也证明在口腔鳞状细胞癌中有
的高表达。
乳铁蛋ft的抗肿痫仉制是由多种机制介导的, F3
前研究认为乳铁蛋白可以抑制血管的发生,
Shimanuira^等研究牛乳铁蛋白对肿瘤诱发血管生
成的影响以及对上皮细胞功能和血管生成相关细胞 因子产生的影响。研究证明牛乳铁蛋白作为血管生成调节剂参与血管发生，通过阻碍内皮的功能及诱导IL-18的生成来完成。Norrby等的研究也认为乳铁蛋白可以抑制肿瘤的血管发生，乳铁蛋白在体外具有抗上皮细胞增殖的活性并且可以强烈抑制血管内皮生长因子介导的血管发生。
Shimamura等 研究证明，牛乳铁蛋白可以抑制血
管生成因子介导 的血管发生的一些过程。所有研究均进一步说明， 乳铁蛋白可以通过抑制血管发生使其具有抗肿瘤活性。体外研究中，乳铁蛋白是否具有调节细胞生长的功能不同学者持有不同的观点。但是近几年的研究发现，人
乳铁蛋白可以抑制头颈部鱗状细胞癌，是 通过直接的细胞毒作用以及系统性的免疫调节作用来实现的。Xiao等的研究也证明乳铁蛋白体外 抑制三种不同的头颈部细胞的增殖。Mckeown研 究认为乳铁蛋白对口腔鳞癌的作用是变化的， 12.5μg/ml乳铁蛋白作用鳞癌细胞48小时可以引起细胞增殖，但72小时是引起细胞死亡。大剂量 (250,100,50μg/ml乳铁蛋白72小时均可以
乳铁蛋白抑制舌癌细胞血管内皮生长因子表达的研究
