茶树CsPAL3基因的亚细胞定位及遗传转化

茶树CsPAL3基因的亚细胞定位及遗传转化

唐秀华1,2,3,4，孙威江1,2,3,4*，龚萍萍5 ，陈志丹2,3,4，曹士先6，谢 凤1,3,4

【摘 要】摘 要:苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)由多基因家族编码，是花青素等多酚物质合成途径的起始酶，对其合成具有调控作用。以紫化茶树武夷奇种C18为材料，采用Gateway技术体系分别构建了茶树的CsPAL3过表达载体pGWB502:CsPAL3和pGWB505:CsPAL3:GFP，并成功将其转入根癌农杆菌GV3101。注射烟草瞬时表达激光共聚焦扫描显微镜可观察到GFP绿色荧光，结果表明CsPAL3主要集中在细胞核和细胞膜中。通过侵染拟南芥，筛选纯合子，获得稳定表达的转CsPAL3基因拟南芥。实时荧光定量PCR(qPCR)检测发现，CsPAL3在转CsPAL3基因拟南芥中的根部表达量显著高于叶片，且CsPAL3基因受光照调控。该结果为进一步研究茶树CsPAL3基因功能以及促进茶树花青素合成与积累的分子调控机理提供科学依据。 【期刊名称】西北植物学报 【年(卷),期】2019(039)003 【总页数】6

【关键词】关键词:茶树；CsPAL3基因；亚细胞定位；光照；表达量

基金项目:国家自然科学基金(31770732)；福建省自然科学基金(2018J01589)；福建省科技计划(2017N3012)

茶树(Camellia sinensis)系山茶科山茶属灌木或小乔木，为多年生木本植物，叶片普遍呈现绿色，富含多种功能成分，具有抗氧化等保健功效。紫化茶树是一种特色的优异茶树种质资源，因其富含花青素、色彩独特且保健性强而备受

关注。花青素生物合成途径分为3个阶段，第1阶段以苯丙氨酸为底物，由PAL和C4H上游结构基因编码蛋白共同催化完成；第2阶段以香豆酰CoA为底物，由CHS、CHI、F3H中游结构基因编码蛋白共同催化完成；第3阶段以二氢黄酮醇为底物，由DFR、ANS(LDOX)和UFGT下游结构基因编码蛋白共同催化完成[1]。其中，PAL基因受光照、温度、干旱等环境因素影响，从而影响花青素合成与积累。唐秀华等[2]成功克隆茶树CsPAL3基因的cDNA全长序列，研究表明，该基因在紫化茶树上的表达量显著高于常规绿叶和白化茶树。为探究紫化茶树CsPAL3基因的亚细胞定位及功能，本研究采用Gateway克隆技术，分别构建农杆菌介导的植物过表达CsPAL3基因载体，进一步转化烟草和拟南芥等模式植物，为验证茶树CsPAL3基因功能奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 试材及取样

紫化茶树武夷奇种C18由武夷星茶业有限公司的种质资源圃提供，烟草和拟南芥由福建农林大学海峡研究院园艺中心提供。遮阴处理：在人工光照气候培养箱中，以正常的光暗周期(16 h∶8 h)环境为对照组，以全黑暗培养为实验组，二者的温度均为23 ℃，湿度均为75%，保持一致。 1.2 试验方法

1.2.1 茶树CsPAL3基因的CDs片段扩增 根据天根植物总RNA提取试剂盒提取供试样品，采用1%琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计检测RNA质量，合格的RNA样品置于-80 ℃冰箱保存，反转录合成cDNA，设计茶树CsPAL3基因的CDs片段引物CsPAL3-TOPO-F和CsPAL3-TOPO-R(表1)，根据TaKaRa高保真酶试剂盒进行CDs片段扩增。PCR扩增的反应体系：5×GXL

缓冲液10 μL，2.5 mmol·L-1dNTP Mix 4 μL, CsPAL3-TOPO-F和CsPAL3-TOPO-R(10 μmol·L-1)各1 μL，模板cDNA 1 μL，Prime STAR 1 μL，ddH2O补足至50 μL。PCR反应程序：98 ℃预变性4 min；98 ℃变性10 s，56 ℃退火15 s，68 ℃延伸135 s，共30循环；68 ℃延伸10 min，12 ℃保存。

1.2.2 茶树CsPAL3的亚细胞定位分析 根据福建农林大学海峡研究院园艺中心的方法，构建pGWB505:CsPAL3:GFP载体，配制侵染液。用1 mL规格的不含针头的一次性注射器吸取侵染液，对准烟草叶片背面，选择叶脉较少的部位，轻轻用力将注射器内的侵染液压送并渗透至叶片组织蔓延，在侵染部位做好标记，每株烟草注射3片为实验组，以未侵染的烟草和注射空载体的烟草分别为阴性对照。侵染后的烟草于温室中培养3 d，将2种阴性对照和实验组的烟草叶片切割侵染部位，分别置于载玻片上，盖上盖玻片，移至激光共聚焦扫描显微镜下观察茶树CsPAL3基因在烟草中的亚细胞定位情况。

1.2.3 茶树CsPAL3的遗传转化 根据福建农林大学海峡研究院园艺中心的方法，构建pGWB502:CsPAL3:GFP载体，配制侵染液，侵染拟南芥花序，筛选至纯合子转基因拟南芥。在转CsPAL3基因拟南芥幼苗期，以野生型拟南芥为阴性对照，选取转CsPAL3基因拟南芥的根、叶片、整株，用液氮速冻，提取各样品的RNA，合成cDNA，以UBQ-qF和UBQ-qR为内参引物，以CsPAL3-qF和CsPAL3-qR为目的基因引物(表1)，进行实时荧光定量PCR技术检测该基因在拟南芥中的表达情况。

1.2.4 遮阴对转CsPAL3基因拟南芥的影响 在人工光照气候培养箱中，以正常光照条件为对照，对转CsPAL3基因拟南芥幼苗分别进行全黑暗处理2 d、4 d、