南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2019，50（10）：2178-2187·2178·南方农业学报ISSN2095-1191；CODENNNXAABhttp://www.nfnyxb.com50卷DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2019.10.06木薯NOX基因家族成员的生物信息学及其表达分析
胡
22*
广1，，梁大成1，
（1长江大学湿地生态与农业利用教育部工程研究中心/湖北省涝渍灾害与湿地农业重点实验室，湖北荆州
2
湖北省主要粮食作物产业化协同创新中心，湖北荆州434025）
434025；
摘要：【目的】搜索鉴定木薯还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOX）基因家族成员，分析其生物学信息及在不同组织和非生物胁迫下的表达模式，为深入研究该家族基因对木薯块根发育的调控机理及提高木薯抗逆性提供理论参考。【方法】从JGI数据库下载木薯的基因组序列，由pfam数据库下载4个NOX蛋白结构域相关的HMM文件，通过HMMER程序筛选NOX基因家族成员，利用生物信息学分析软件对该家族蛋白的理化性质、氨基酸序列和结构特征进行分析。基于GEO数据库的转录组测序（RNA-Seq）数据，对木薯NOX基因家族成员在不同组织和干旱胁迫下的表达模式进行分析。【结果】从木薯基因组中共鉴定到15个NOX基因家族成员，包括9个NOX基因和6个FRO基因（NOX祖先基因）。FRO基因的外显子数（6~9个）明显少于NOX基因的外显子数（11~14个），且FRO基因的内含子序列较NOX基因短，NOX基因的第一个外显子相对保守。15个NOX基因家族成员分布在木薯的9条染色体和1个结构支架上，且均被定位在染色体末端，除6号染色体有4个基因、8号和14号染色体有2个基因外，其他染色体均只有1个基因。木薯NOX蛋白的分子量和氨基酸数明显高于FRO蛋白，而理论等电点（pI）差异不明显。FRO蛋白含6~9个保守跨膜结构域，而NOX蛋白均只含4个跨膜螺旋区，且均位于第350~750位氨基酸残基。木薯NOX家族蛋白有10个保守结构域，其中Motif1和Motif8存在于所有的NOX和FRO蛋白中，Motif6为NOX蛋白所特有，Motif3只独立存在于FRO蛋白中。NOX蛋白均具有典型的保守结构域和相似的蛋白质结构，其脱氢酶结构域明显折叠成催化域裂缝结构，且C末端氨基酸极度保守。由RNA-Seq数据的基因表达谱可知，NOX基因家族成员在不同木薯叶片、中静脉、叶柄、茎、侧芽、茎尖分生组织、根尖分生组织、易碎胚性愈伤组织、胚性愈伤组织（OES）和贮藏根中均有表达，但呈不同的表达模式，其中，Manes.14G042600和Manes.S089900在储藏根中高表达，Manes.06G128700和Manes.09G172500在须根和根尖分生组织中高表达。在木薯品种KU50和新选048的叶片中，Manes.14G042600基因在干旱胁迫下呈上调表达，推测NOX基因在特定组织及响应非生物胁迫过程中扮演重要角色。【结论】木薯NOX基因家族成员具有保守基因结构，其编码蛋白具有保守的功能域，尤其是C端氨基酸序列；NOX基因表达具有组织特异性，部分成员的表达受非生物胁迫的影响。FRO蛋白和NOX蛋白具有较明显的共进化关系。
关键词：木薯；还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOX）；基因家族成员；生物信息学；干旱胁迫中图分类号：S533.035.3文献标志码：A文章编号：2095-1191（2019）10-2178-10
BioinformaticsofcassavaNOXgenefamilyand
itsexpressionanalysis
22*
HUGuang1，，LIANGDa-cheng1，
（1EngineeringResearchCenterofEcologyandAgriculturalUseofWetland，MinistryofEducation/HubeiKey
LaboratoryofWaterloggingDisasterandWetlandAgriculture，Jingzhou，Hubei434025，China；2
HubeiCollaborativeInnovationCenterforGrainIndustry，Jingzhou，Hubei434025，China）Abstract：【Objective】Genefamilymembersofreducednicotinamideadeninedinucleotidephosphateoxidase（NOX）
incassavawereidentifiedthroughbioinformaticminingofpubliclyavailabledata，andgeneexpressionprofilesindi-fferenttissuesandundervariousabioticstresseswerealsoanalyzed，whichlaidtheoreticalreferencesforfurtherstudiesontheregulationmechanismofNOXgenesoncassavatuberizationandimprovementofstressresistanceofcassava.【Method】CassavagenomesequencesweredownloadedfromGJIdatabaseandfourNOXdomain-relatedHMMfilesweredownloadedfromthepfamproteindatabase，thentheHMMERprogramwasperformedtocharacterizetheNOXfamilymembers.Thephysicalandchemicalproperties，aminoacidsequenceandstructuralcharacteristicsofthefamilyproteinwereanalyzedbybioinformaticssoftware.Basedontranscriptomesequencing（RNA-Seq）dataatGEOdatabase，theex-pressionprofilesofcassavaNOXgenefamilymemberswasfurtheranalyzedinvarioustissuesandunderdroughtstress.收稿日期：2019-06-16基金项目：国家自然科学基金项目（31671257）作者简介：*为通讯作者，梁大成（1979-），博士，教授，主要从事活性氧及生物大分子长距离运输研究工作，E-mail：dachengliang
@yangtzeu.edu.cn。胡广（1995-），主要从事生物信息学研究工作，E-mail：1078974559@qq.com
10期胡广等：木薯NOX基因家族成员的生物信息学及其表达分析
·2179·【Result】Atotalof15membersoftheNOXgenefamilywereidentifiedfromthecassavagenome，including9NOXgenes，6FROgenes（ortheancestralNOXgenes）.TheexonsofNOX（11-14）genegreatlyoutnumberedthatoftheFROfamily（6-9）.TheintronsequenceofFROgenewasshorterthanthatofNOXgeneandthefirstexonofNOXgenewasrelativelyconserved.FifteenmembersoftheNOXgenefamilyweredistributedon9differentchromosomesand1scaffoldofcassava，allofthemwereanchoredneartheendpointsofchromosomes.Exceptforchromosome6（4genes）andchromosome14（2genes），therewasonlyoneNOXgeneineachchromosome.ThemolecularweightandaminoacidnumberofNOXproteinincassavawerelowerthanFROprotein，butthetheoreticalisoelectricpoint（pI）differencewasnotobvious.FROproteinsharbored6to9conservedtransmembranedomains，whereasalltheNOXproteinshadonly4trans-membranedomains.Thereare10conserveddomainsofNOXfamilyproteinsincassava，withMotif1andMotif8inallNOXandFROproteins，Motif6onlyinNOXproteins，andMotif3onlyinFROproteins.Three-dimensionhomologousmodelingfurtherrevealedthatallNOXproteinshadtypicalconserveddomainsandsimilarproteinstructures.Thedehy-drogenasedomainfoldedobviouslyintothecatalyticdomainfissurestructureandtheC-terminalsequenceappearedasanextremelyconservedmotif.TheexpressionprofileoftheNOXgenesusingRNA-Seqdatadisplayeddifferentexpressionpatternsacrossdifferenttissues，includingleaves，midvein，petiole，stem，lateralbud，shootapicalmeristem（SAM），rootapicalmeristem（RAM），friableembryogeniccallus（FEC），organizedembryogenicstructures（OES）andstorageroots.Someofthemwerehighlyenrichedinstorageroot，forexampleManes.14G042600andManes.S089900，however，Manes.06G128700andManes.09G172500werehighlyexpressedinfibrousrootandRAM.Notably，intheleavesofva-rietiescv.KU50andXinxuan048，Manes.14G042600wasupregulatedunderdroughtstress，implyingapotentialroleofNOXgeneinrespon-dingtoabioticstress.【Conclusion】CassavaNOXgenefamilymemberscontainconservedgenestruc-tureandtheirencodedproteinsalsocontainconservedfunctionaldomains，particularlyintheirC-terminalregions，sug-gestingtheunderlyingco-evolutionaryrelationshipbetweenFROproteinandNOXprotein.TheNOXgenesaretissuespe-cific，andsomeofthemareresponsivetoabioticstress.
Keywords：cassava；reducednicotinamideadeninedinucleotidephosphateoxidase（NOX）；genefamilymembers；bioinformatics；droughtstress
0引言
【研究意义】木薯（ManihotesculentaCrantz）是一种重要的块根粮食作物，主要种植于热带和亚热带地区，其块茎中淀粉含量较高（70%~90%），约是水稻光合速率的2倍（Ihemereetal.，2006；SantaBrígidaetal.，2014；Oyelakinetal.，2015）。研究发现，块茎的发育和储藏根采后生理退化与活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）的产生密切相关，活性氧能诱导超氧化物离子引起非生物胁迫，在响应多种与植物氧化还原反应相关的生物学过程中发挥重要作用（Xuetal.，2013；Liuetal.，2017）；而还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOX）是生成活性氧的主要催化酶（BedardandKrause，2007；LambethandNeish，2014）。因此，利用生物信息学方法研究木薯NOX基因家族，揭示其成员数量、理化特性、染色体位置分布、基因结构、进化关系、蛋白三维结构和时空表达特征等，对研究木薯块茎的发育生物学特性具有重要意义。【前人研究进展】NOX普遍存在于植物、动物和真菌中（BedardandKrause，2007）。在动物细胞中，NOX是一种面向细胞外空间的酶复合物，包含膜结合异质二聚体即黄细胞色素b558（由gp91phox和p22phox组成）及吞噬细胞的4种胞质成分即p47phox、p67phox、p40phox和小分子蛋白GTPaseRac（Vignais，2002；QuinnandGauss，2004）。当细胞受到刺激后，胞质成分与黄酮细胞色素b558相互作用，激活NOX，催化发生化学反应，最终产生过氧
化氢（H2O2）和羟基自由基（OH）等活性氧（Vignais，2002；QuinnandGauss，2004；Mizrahietal.，2006）。在植物细胞中，NOX被称为呼吸爆发氧化酶同源物（Rbohs），也是哺乳动物吞噬细胞gp91phox的同源物，调控活性氧的生成（SagiandFluhr，2006）。活性氧在植物生长调控和次生代谢反应中发挥重要作用，不仅破坏由氧化代谢产生有害因子的细胞并导致其程序性细胞死亡，还作为植物的信号分子响应非生物胁迫（Mittleretal.，2011；Dietzetal.，2016）。近年来，已有大量研究表明，NOX基因参与植物的发育调控和逆境胁迫反应。在水稻中，已有9个NOX基因家族成员被分离鉴定出来，其中，OsNOX1、OsNOX2和OsNOX3基因在干旱和盐胁迫下过表达能明显提高水稻的抗逆性和耐受性（Naganoetal.，2016）；Os-NOX9基因高效表达能促进根的形成（Yamauchietal.，2017）。在拟南芥中，NOX基因家族成员AtRbo-hD在低氧胁迫下通过H2O2介导的乙烯信号释放途径而抑制根系伸长（Kayaetal.，2014），在叶片中，AtRbohD基因通过响应脱落酸激素的信号传导而控制气孔开合（Chaouchetal.，2012）。在小麦中，NOX基因家族成员在不同组织中均有特异表达，其中，TaNOX3和TaNOX13基因在小麦叶片中高效表达，TaNOX11基因主要在茎中表达，TaNOX12基因则主要在幼穗中表达，TaNOX8基因在冷害和热害胁迫下均呈下调表达（李日和陈坤明，2015；Huetal.，
·2180·南方农业学报50卷2018），说明这些基因在调控小麦的生长发育和抗逆反应方面发挥重要作用。在番茄中，SlRboh1基因高表达促使活性氧积累，以适应更高的二氧化碳浓度和油菜素类固醇含量（Xiaetal.，2014）。在草莓中，NOX基因过表达可明显提高植株的冷害耐受性，抑制NOX基因表达会减少活性氧生成量导致细胞程序性死亡，耐受性降低（Zhangetal.，2018）。【本研究切入点】迄今，有关NOX基因家族的研究主要集中于温带禾本科植物或模式植物等，而鲜见针对木薯NOX基因家族的生物学信息及时空表达特征的研究报道，对不同逆境条件下该基因家族的分子调控机制尚不清楚。【拟解决的关键问题】从木薯基因组中鉴定出NOX基因家族成员，分析其基因结构、系统发育进化关系、染色体位置分布、编码蛋白的保守结构域和三维结构及不同组织和非生物胁迫下的表达情况，为深入研究该家族基因对木薯块根发育的调控机理及提高木薯抗逆性提供理论参考。
1材料与方法
1.1
木薯NOX基因家族成员检索及鉴定
从JGI数据库（https：//genome.jgi.doe.gov/）下载木薯的基因组序列，包括编码区（CDS）序列和基因组GFF3注释文件。利用pfam数据库下载NOX蛋白结构域相关的4个HMM文件，即NADPH_Ox、Fer-ric_reduct、NAD_Binding6和FAD_Binding8，并使用HMMER程序筛选NOX基因家族成员，E阈值设为10-E5，并在CDD数据库进行验证（Eddy，2011；Marchler-Baueretal.，2017）。
1.2木薯NOX基因家族成员基因结构分析及染色体定位
将NOX基因cDNA序列与木薯基因组数据库http：//www.phyzome.net/cassava）中相应的基因组DNA序列进行比对，分析NOX基因中内含子和外显子的结构特点，并利用GSDS对基因结构进行可视化（Guoetal.，2007）。从木薯基因组数据中获得NOX基因的染色体位置和每条染色体的总长度，利用MapGene2Chrom（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）在线工具绘制NOX基因的染色体位置分布图。1.3蛋白理化性质及保守结构域预测
利用ExPASy预测NOX基因家族成员编码蛋白的理化性质（Gasteigeretal.，2003）；使用HMMER在线预测蛋白的跨膜结构域；利用MEME在线预测蛋白的保守基序，基序最大数目设置为10，基序长度设为6~50个氨基酸（Baileyetal.，2009），并将预测的保守基序和蛋白结构域进行对应分析。1.4
蛋白三维结构预测
利用SWISS-MODEL预测木薯NOX蛋白的三维结构。同源建模模板为NOX5蛋白（ProteinData-bankID5o0x.1.A），并利用PyMOL显示NOX蛋白脱氢酶结构域的保守末端。1.5系统发育进化树构建
利用ClusterW进行多重序列比对，采用MEGA7.0以最大似然法（Maximum-Likelihood）构建系统发育进化树，并利用自举重采样法，设置1000次自举重复对分支的可靠性进行评估（Kumaretal.，2009）。1.6木薯转录组测序（RNA-Seq）数据获取及表达特性分析
从GEO数据库下载11个木薯组织的RNA-Seq数据（GSE82279）及干旱胁迫下叶片组织的RNA-Seq数据（GSE98537）（Wislonetal.，2017）。利用R语言，基于FPKM值绘制基因表达谱，以Log2FoldChangeLog2FC）值绘制差异表达热图。
2结果与分析
2.1木薯NOX基因家族成员鉴定及基因结构分析结果
从木薯基因组中共鉴定获得15个NOX基因家族成员，包括9个NOX基因和6个FRO基因（NOX祖先基因），根据基因外显子位置分布可将其明显划分为两个类群（NOX基因和FRO基因），如图1所示。FRO基因的外显子个数明显少于NOX基因，其中Manes.06G16800基因最少，仅含有6个外显子，其他FRO基因含7~9个，且相对于NOX基因，FRO基因的内含子序列较短。NOX基因的外显子数为11~14个，平均为13个，但Manes.02G016200、Manes.08G057200和Manes.S089900基因的内含子区域较其他基因长，且NOX基因的第一个外显子相对保守，推测是其编码蛋白重要的功能域。
2.2木薯NOX基因家族成员的染色体位置分布情况
利用MapGene2Chrom绘制木薯NOX基因家族成员在木薯染色体上的位置，结果如图2所示。这些基因分布在木薯的9条染色体和1个结构支架上，且均被定位在染色体末端，除6号染色体、8号染色体和14号染色体外，其他染色体均只有1个基因。其中，6号染色体上分布的NOX基因和FRO基因最多，且NOX基因Manes.06G128700与2个FRO基因Manes.06G109600和Manes.06G151600的距离较近；14号染色体上分布的NOX基因Manes.14G042600与FRO基因Manes.14G023200相距也较近（图2），说明上述FRO基因和NOX基因可能存在连锁关系。
（（
木薯NOX基因家族成员的生物信息学及其表达分析
