高效液相色谱的应用研究进展
【摘要】从1903年,色谱的开始使用,各种色谱技术应运而生,其中高效液相色谱由于其分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高、检测自动化、适用范围广等优点,作为物质分离的重要工具,在各个方面都取得了很大的发展,并且出现了许多的新型色谱。本文综述了变性高效液相色谱在生物遗传方面的应用,及高效液相色谱在医学方面的应用。
【关键字】HPLC(高效液相色谱) DHPLC(变性高效液相色谱)
1.高效液相色谱概要
色谱法是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同,当流动相推动样品中的组分通过固定相时,在两相中进行连续反复多次分配,从而形成差速移动,达到分离的方法。根据流动相的状态可分为气相色谱法和液相色谱法。在液相色谱中,采用颗粒十分细的高效固定相并采用高压泵输送流动相,全部工作通过仪器来完成。这种色谱称为高效液相色谱(1iighperformance liquid chromatography,HPLC)。
由于高效液相色谱法有分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高、检测自动化、适用范围广等优点,高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手段,在有机化学、生物化学、医学、药物学与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛。另外,在高效液相色谱法的基础上不断发展,变性高效液相色谱法(DHPLC)随之兴起,广泛用于生物学、遗传学等领域。
2.高效液相色谱在生物学的应用
变性高效液相色谱法(DHPLC)是在高效液相色谱法的基础上发展起来的一种新方法。DHPLC采用高压闭合液相流路,将DNA样品自动注入并在缓冲液携带下流过DNA分离柱,通过缓冲液的不同梯度变化,在不同分离柱温度条件下,由荧光检测被分离的DNA样品,从而实现对DNA不同的分析它因使用的温度不同而有不同的应用
价值:①在非变性温度(40℃~5O℃ )条件下对不同长度的双链DNA进行分离,用于定量反相PCR、长度多态性分析以及杂合性缺失(LOH)分析等;②在部分变性温度(51℃~75℃)条件下进行基因突变,单核苷酸多态性和CpG甲基化的检测;③在完全变性温度(70℃~8O℃)条件下对寡核苷
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酸进行质量控制和纯化,RNA分离及已知位点基因型的分析等。
曹际娟等利用DHPLC 能够吸收检测DNA 片段并具有高度敏感性的特点,根据O1、O139、非01、非O139群霍乱弧菌外膜蛋白ompW 基因的特有基因组序列,进行PCR 扩增,然后利用DHPLC 检测,一次可同时自动化分析数百个样本,达到快速检测的目的.PCR-DHPLC 技术与实时PCR 技术检测致病菌相比,同样具备快速的优势,但在测试成本上却远远低于实时PCR 技术,因而具有更广阔的应用前景。[2] 曲直等对高效液相色谱法分析放线菌渊G+C 冤mol%含量的方法进行了摸索,找到了分离分析的较佳条件,用此方法对分离的8 株红树林放线菌进行了G+Cmol%含量的测定,实验结果表明,DNA 碱基分离效果好,无杂峰干扰,通过分析验证所测得的G+Cmol%含量与预期值相符,且检测速度快,因此高效液相色谱法为直接测定渊G+C 冤mol%含量提供了一种快速简洁而精确的方法。[3]
3.高效液相色谱在遗传学的应用
变性高效液相色谱( denatu ring h igh perfo r2mance liqu id ch romatography, DHPLC) 是一项在单链构象多态性( single2st rand confo rmat ional po lymo rph ism ,SSCP) 和变性梯度凝胶电泳(denatu ring gradien t gelelect ropho resis, DGGE ) 基础上发展起来的新的杂合双链突变检测技术。变性高效液相色谱(dHPLC)是一种高通量筛选DNA 序列变异的新技术. 该方法具有自动化、准确快速、检出率高等特点,现已广泛应用于与人类疾病相关基因的突变分析其原理是通过HPLC 在部分变性的条件下将发生错配的异源杂合双链DNA 与完全匹配的同源双链DNA 分离开来。施锦绣通过对DHPLC 与DNA 测序进行比较,与
直接测序相比较, 有自动化程度高、价格便宜的优点。通过DNA 样品混合池, 在大量样本的筛检中DH2PLC 还有快速检测的优势。因此,DHPLC 不失为大规模开展人类基因组SN P 筛检和分型的一种有效手段。[4]韩宗福等利用CAU36和CAU328两个EST —SSR 标记,结合dHPI C 技术,鉴定了35份不同小麦品种(系)中的等位基因变异类型,并配制了4×6的小麦双列杂交组合,以抽穗期的穗下节节问为材料,对这两个基因在杂交F 代中的等位基因表达差异进行了分析,发现其中一个基因的等位表达变异与部分杂交种的株高之间存在显著的相关性.[5]
4.高效液相色谱在医学的应用
HPLC 在测定蛋白活性上有重要的应用。应用HPLC 测定肝细胞色素P450活性对新药临床安全性评价和药物相互作用研究具有重大意义。金科涛等人应用液相一质谱串联技术
(LC-MS/MS)通过用多种CYP45(I特异性底物与微粒体蛋白共同孵育的方法可以同时检测
多个底物的代谢物,以评价各种CYP450亚型酶的活性。
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近年来,各种现代分析手段在药物分析中的应用广泛,受到了药物分析工作者的关注。铂类配合物作为一类无机抗癌药物,涉及的主要化学分析手段有炽灼残渣法、高效液相色谱法(HPLC)、薄层层析法、紫外分光光度法及毛细管电泳法等。其中,高效液相色谱法因分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高、检测自动化、适用范围广等优点,已成为近年来铂类抗癌配合物化学分析最常用的手段.
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高效液相色谱作为物质分离的重要工具,在各个方面都取得了很大的发展,出现了许多的新型色谱。在分配机制方面,亲和色谱则根据另一类分配机制而进行分
高效液相色谱的应用研究进展
