多重PCR方法同时检测3种转基因作物外源基因
李忆
【摘 要】摘要 根据目前转基因作物常见的外源基因，选择出现几率较高的CaMV 35S、NOS、CP4-epsps 3个基因，引物分别参照国家相关标准中的特异性序列，建立可同时特异性地检测3种外源基因的多重PCR检测体系。同时，对反应条件进行优化并测试其特异性和灵敏度。已知样品检测证明，此多重PCR体系具有良好的可靠性。利用此体系在对康定县境内出售大米、玉米样品检测中未检测相关基因。 【期刊名称】现代农业科技 【年(卷),期】2014(000)022 【总页数】3
【关键词】关键词CaMV 35S；NOS；CP4-epsps；多重 PCR；检测
转基因作物（GMP）是指利用分子生物学手段，将某些生物的基因转移到作物中去，使其出现原物种不具有的性状或产物[1]。近年来，随着转基因技术迅速发展，转基因作物种植面积不断加大，但其对自然环境安全、人体健康、生物多样性等可能造成的负面影响引起各国的关注。为此，日本、欧盟等开始对转基因作物实行强制性标识制度[2]，同时转基因检测技术的需求大大增加，且对准确性、特异性提出严格要求。我国施行《农业转基因生物标识管理办法》，要求对5类转基因生物涉及的17种转基因产品标识[3]。为贯彻标识制度，需要建立一套方便、实用的转基因产品检测技术。
目前，转基因产品检测方法分为DNA检测、蛋白质检测[4]。蛋白质检测方法有试纸条检测、ELISA，DNA检测方法有基因芯片、PCR、Southern杂交等
[5-7]。多重PCR技术是在同一PCR反应体系里加入2对或2对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、试剂、操作过程与一般PCR相同[8]。多重PCR技术应用十分广泛，包括动物和植物生物学、人类生物医学、食品卫生等。多重PCR检测方法具有高效、快捷、准确和经济简便的特点。该研究拟通过对多重PCR检测方法进行优化并建立起包括CaMV 35S、NOS、CP4-epsps 3种外源基因的多重PCR检测技术体系。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验用材料。所有转基因及非转基因材料均购自欧盟标准物质和计量研究所，市售大米、玉米均购自康定县各大超市及农贸市场。
1.1.2 主要试剂。植物基因组提取试剂盒、Master Mix购于成都博瑞克生物技术有限公司；引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成；标准分子量（M）大小依次为100 bp、250 bp、500 bp、750 bp、1 000 bp、1 200 bp；CTAB、SDS 等生化试剂均为国产分析纯。 1.2 基因的确定与引物的设计
根据目前转基因商业化材料的分子特征选择出现几率较高的CaMV 35S、NOS、CP4-epsps 3个基因作为检测基因，引物分别参照国家相关标准中的特异性序列（表1）。 1.3 样品DNA提取
样品DNA提取按照转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化（农业部1485号公告-4-2010）之试剂盒方法进行[9]，测定提取DNA浓度和质量。 1.4 多重PCR方法的建立
1.4.1 多重PCR单基因特异性试验。反应体系：2×Master Mix 12.5 μL，F、R 各 1 μL（10 μmol/L），模板 DNA 2 μL（模板浓度为 25 ng/μL），加 ddH2O 至 25 μL。
扩增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72℃5 min，4℃保存。PCR反应结束后将反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行结果分析。
1.4.2 多重PCR检测方法的建立及条件优化。
（1）多重PCR退火温度的优化。反应体系：2×Master Mix 12.5 μL，3 对引物中 F、R 各 0.25 μL（10 μmol/L），模板 DNA 2 μL（模板浓度为 25 ng/μL），加 ddH2O 至 25 μL。
扩增程序：95℃预变性5 min；94℃30 s，退火温度设置梯度 50、54、56、58、60、64℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30 个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用3%琼脂糖凝胶电泳进行结果分析，筛选出最佳退火温度。
（2）多重PCR引物浓度的优化。反应体系：2×Master Mix 12.5 μL，3 对引物终浓度（μmol/L）按照 0.2∶0.2∶0.2、0.1∶0.1∶0.1、0.2∶0.2∶0.1、0.1∶0.2∶0.1 和 0.1∶0.2∶0.1 设置引物浓度梯度，模板DNA 2 μL（模板浓度为 25 ng/μL），加 ddH2O 至 25 μL。扩增程序选择退火温度优化后确定的程序。PCR产物用3%琼脂糖凝胶电泳进行结果分析，筛选出最佳引物浓度配比。
1.5 多重PCR方法的实例应用
利用该研究建立的多重PCR检测体系，对实验室保存的已知样品进行实例验证，以期进一步检验建立的多重PCR检测体系的可靠性和准确性。
多重PCR方法同时检测3种转基因作物外源基因
