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哈茨木霉及贝莱斯芽孢杆菌土壤宿存探究

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Advances in Microbiology 微生物前沿, 2020, 9(2), 66-73

Published Online June 2020 in Hans. http://www.hanspub.org/journal/amb https://doi.org/10.12677/amb.2020.92011

Study on the Soil Persistence of Trichoderma harzianum and Bacillus velezensis

Zhendong Xu, Jianfeng Hu, Jiaqi Shen, Ying Wang, Changsheng Sun*

Zhejiang BioAsia Pharmaceutical Co., Ltd., Pinghu Zhejiang

ththth

Received: May 29, 2020; accepted: Jun. 17, 2020; published: Jun. 24, 2020

Abstract

Wheat head blight is caused by some Fusariums of Fusarium genus. It is a serious disease that widely exists in wheat planting areas all over the world. Our previous studies found that Tricho-derma harzianum and Bacillus velezensis can significantly reduce the incidence rate of wheat head blight, but the duration of its control is unknown. Therefore, through this experiment, we ex-plored the survival and persistence dynamics of these two biocontrol bacteria in soil, and found that Trichoderma harzianum and Bacillus velezensis can exist in soil for a long time. The survival rates of the Trichoderma harzianum and Bacillus velezensis were 29% and 52% respectively in the Nylon mesh cage experiment, which were significantly higher than 1.3% (p = 0.0007) and 3% (p = 1.18 × 10?7) of the field experiment, indicating that repeated application of pesticides was needed every year in order to obtain good control effect. After accumulating a certain amount of microor-ganism, the dosage and the times of control can be reduced properly.

Keywords

Trichoderma harzianum, Bacillus velezensis, Persistence

哈茨木霉及贝莱斯芽孢杆菌土壤宿存探究

徐振栋，胡建峰，沈佳奇，王莹，孙长胜*

浙江泛亚生物医药股份有限公司，浙江平湖

收稿日期：2020年5月29日；录用日期：2020年6月17日；发布日期：2020年6月24日

通讯作者。

文章引用: 徐振栋, 胡建峰, 沈佳奇, 王莹, 孙长胜. 哈茨木霉及贝莱斯芽孢杆菌土壤宿存探究[J]. 微生物前沿, 2020, 9(2): 66-73. DOI: 10.12677/amb.2020.92011

徐振栋等

摘要

小麦赤霉病是由镰孢属多种镰刀菌侵染引起的，广泛存在于全世界小麦种植区的一种严重病害。我们此前的研究发现，哈茨木霉和贝莱斯芽孢杆菌在田间能显著减少小麦赤霉病的发病率，但对其防效的持续时间还未可知，因此，通过本次实验，对这两种生防菌在土壤中的生存情况和宿存动态进行探究，发现哈茨木霉和贝莱斯芽孢杆菌能在土壤中长期存在，尼龙纱网笼实验中的两种菌的宿存率分别为29%和52%，均显著高于大田实验的1.3% (p = 0.0007)和3% (p = 1.18 × 10?7)，说明为了获得良好的防治效果初始年份每年都需要重复施药，待积累一定带菌量后，可适当减少用药量和防治次数。

关键词

哈茨木霉，贝莱斯芽孢杆菌，宿存

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Open Access 1. 引言

小麦赤霉病是由镰孢属多种镰刀菌侵染引起的，广泛存在于全世界的小麦种植区的一种毁灭性病害[1]。其在我国华南和长江中下游地区冬麦区以及北方春麦区普遍存在[2]。我国近代曾多次发生大流行，给我国小麦产业造成了极大的损失，导致了我国江南部分地区减少甚至停止小麦的种植[3]。目前我们主要使用化学农药对小麦赤霉病进行防治，而化学农药具有容易造成环境污染，病菌会产生抗药性等缺点，因此，越来越多人将目光聚焦到了生物防治上面。

目前，国内外对小麦赤霉病的微生物防治研究已经取得了很大的进展，发现了许多种细菌、真菌均具有小麦赤霉病防治的功能，主要有芽孢杆菌和木霉等[4]。微生物防治应用的最大优点就是生防菌可以在土壤中定殖、宿存，当侵染源达到一定数量时就可获得自然控制病原微生物的能力。我们此前的研究发现哈茨木霉和贝莱斯芽孢杆菌在田间能显著减少小麦赤霉病的发病率，但我们对其防效的持续时间还未可知，因此我们通过本次实验，对这两种生防菌在土壤中的生存情况和宿存动态进行探究，定时取样，检查生防菌存活情况及动态，根据生防菌的动态，确定防治策略。

2. 材料与方法

2.1. 材料

2.1.1. 供试材料

哈茨木霉(Trichoderma harzianum) BACC0957菌株：由浙江泛亚生物医药股份有限公司提供；哈茨木霉孢子粉(250亿CFU/g)：浙江泛亚生物医药股份有限公司实验室生产；贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) BACC01558菌株：由浙江泛亚生物医药股份有限公司提供；贝莱斯芽孢杆菌菌粉(100亿CFU/g)：浙江泛亚生物医药股份有限公司实验室生产；实验土壤：于浙江泛亚医药股份有限公司绿化处采集。 2.1.2. 仪器与试剂

ZHJH-C1214B超净工作台：上海智城分析仪器制造有限公司；ZWYR-211D卧式脚踏开门型真彩触

DOI: 10.12677/amb.2020.92011

微生物前沿

徐振栋等

摸屏摇床：上海智城分析仪器制造有限公司；ME204电子天平：梅特勒–托利多国际贸易有限公司；HPX-300BSH-3恒温恒湿培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司。

LB固体培养基：葡萄糖10.0 g，酵母提取物10.0 g，胰蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂20 g，加蒸馏水1000 ml，121℃高压蒸汽灭菌20分钟；孟加拉红固体培养基：蛋白胨5.0 g，葡萄糖10.0 g，磷酸二氢钾1.0 g，硫酸镁(MgSO4?7H2O) 0.5 g，琼脂20.0 g，孟加拉红0.033 g，氯霉素0.1 g，加蒸馏水1000 ml，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。

2.2. 方法

2.2.1. 哈茨木霉及贝莱斯芽孢杆菌土壤存活实验

孟加拉红固体培养基、LB固体培养基、载玻片121℃高压蒸汽灭菌20分钟，待冷却至50℃~60℃，以无菌载玻片蘸取培养基，使载玻片两面涂满培养基，放置冷却，待培养基凝固后去除一面的培养基，仅保留单面培养基，制成孟加拉红玻片和LB玻片，各做16片。在孟加拉红玻片上接种哈茨木霉，在LB玻片上接种贝莱斯芽孢杆菌，分别于26℃和30℃下保湿培养3 d。

将一片尼龙纱网覆盖在载玻片上，两端用胶带粘上，然后将载玻片放入饭盒中，覆盖上菜园壤土中(土壤湿度以手捏成团，一拍即散为准)，每种菌重复16个，保湿放置，并定期(第10天，第20天，1个月，2个月，4个月，6个月，8个月，10个月)抽出2片，将载玻片菌面置于相应培养基的平板上，哈茨木霉载玻片培养7天，贝莱斯芽孢杆菌培养2天，检查接种物的存活情况。 2.2.2. 混菌法探究哈茨木霉及贝莱斯芽孢杆菌在土壤中的动态变化情况

将接种物哈茨木霉、贝莱斯芽孢杆菌，接入菜园壤土(土壤自然晾干过100目筛，湿度以手捏成团，一拍即散为准)，接种量为每100 g土样中加入2 g菌粉，混匀。混匀后装入20 cm × 10 cm × 10 cm的尼龙纱网笼中，埋入菜园土中，笼的上方与地表齐平。每隔一个月取样一次进行检测，每次取土5 g，烘干后打碎混匀，再从中取土1 g，溶于100 ml水中，摇床25℃，180 rpm震荡15分钟，随后取1 ml悬浊液加入9 ml蒸馏水试管中进行梯度稀释，稀释至10?8，各梯度稀释液分别吸取100 ul在相应的培养基上涂平板，各自培养合适时间，观察菌落数量，以菌落总数在10~30个为宜，确定一个合适的稀释浓度。首次确定合适稀释浓度后，后面一个月可根据上一个月的稀释浓度上下浮动1个梯度进行确认。选择合适的稀释浓度，稀释土壤，取100 ul稀释液涂平板(4~6个)，各自培养合适的时间后计数哈茨木霉和贝莱斯芽孢杆菌的成菌落单位(CFU)，取平均数。按下列公式计算单位土壤的菌落数：

单位土壤(g)中的菌落数(CFU/g) = 各平板菌落平均数 × 稀释倍数 × 10

2.2.3. 大田试验后土壤中哈茨木霉及贝莱斯芽孢杆菌动态变化

每隔一个月取大田土样一次进行检测，五点取样法每次取土50 g，烘干后打碎混匀，再从中取土1 g，溶于100 ml水中，摇床25℃，180 rpm震荡15分钟，随后取1 ml悬浊液加入9 ml蒸馏水试管中进行梯度稀释，稀释至10?7，各梯度稀释液分别吸取100 ul在相应的培养基上涂平板，各自培养合适时间，观察菌落数量，以菌落总数在10~30个为宜，确定一个合适的稀释浓度。首次确定合适稀释浓度后，后面一个月可根据上一个月的稀释浓度上下浮动1个梯度进行确认。选择合适的稀释浓度，稀释土壤，取100 ul稀释液涂平板(4~6个)，各自培养合适的时间后计数哈茨木霉和贝莱斯芽孢杆菌的成菌落单位(CFU)，取平均数。按下列公式计算单位土壤的菌落数：

单位土壤(g)中的菌落数(CFU/g) = 各平板菌落平均数 × 稀释倍数 × 10

2.2.4. 数据统计分析

实验数据使用Excel软件进行数据处理并制作菌落数曲线图。

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徐振栋等

3. 结果与分析

3.1. 哈茨木霉及贝莱斯芽孢杆菌土壤存活情况

在载玻片上接种哈茨木霉及贝莱斯芽孢杆菌，培养3 d后插入土壤中，定期检查存活情况，具体结果如表1所示。

Table 1. Survival of Trichoderma harzianum and Bacillus velezensis in soil 表1. 哈茨木霉及贝莱斯芽孢杆菌土壤存活情况

贝莱斯芽孢杆菌哈茨木霉

2019年9月2日

存活存活

9月12日存活存活

9月22日存活存活

10月22日存活存活

12月22日 2020年2月22日存活存活

存活存活

4月22日存活存活

玻片实验结果显示，哈茨木霉和贝莱斯芽孢杆菌能在土壤中长期存在，而它们又能抑制镰刀菌生长，减少镰刀菌在土壤中的菌量，因此能对赤霉病有一个长期的抑制效果。

3.2. 哈茨木霉及贝莱斯芽孢杆菌在混菌土壤中的动态变化情况

采用混菌法进行实验，每100 g土壤中混入2 g菌粉，装入尼龙纱网笼中，埋入土中，每月检测结果如下表2和图1，图2所示。

Table 2. Changes of colony forming units of Trichoderma harzianum and Bacillus velezensis (mixed method) 表2. 哈茨木霉及贝莱斯芽孢杆菌菌量变化情况(混菌法)

2019年8月 15日

9月15日 10月15日 11月15日 12月15日 1.08 × 108 1.3 × 107

2.33 × 107 1.05 × 107

3.00 × 107 1.03 × 107

4.25 × 107 7.25 × 106

2020年1月

2月15日 3月15日 4月15日

15日 4.8 × 107 6.8 × 106

3.25 × 107 3.75 × 107 2.0 × 107 6.33 × 106 7.0 × 106

6.5 × 106

哈茨木霉(CFU/g) 1.12 × 108 贝莱斯芽孢杆菌

(CFU/g)

4.2 × 106

Figure 1. Changes of colony forming units of Trichoderma harzianum (mixed method)

图1. 哈茨木霉菌量变化情况(混菌法)

DOI: 10.12677/amb.2020.92011

微生物前沿

徐振栋等

Figure 2. Changes of colony forming units of Bacillus velezensis (mixed me-thod)

图2. 贝莱斯芽孢杆菌菌量变化情况(混菌法)

由表2和图2可知，混在土中的贝莱斯芽孢杆菌成菌落总数第一个月呈显著上升，上升约3倍，这可能是由于第一次检测时贝莱斯芽孢杆菌菌粉刚从冰箱取出，还未活化，导致首次检测成菌落单位数量偏少，埋于土中一个月后，贝莱斯芽孢杆菌活化，此时温、湿度均对该菌增殖有利，在充分利用土壤养分基础上增殖，成菌落总量出现显著上升。从第二个月开始，土壤养分逐步显得不足，而且此时江淮一带气温开始降低，该菌繁殖生长速率下降，土中贝莱斯芽孢杆菌的成菌落单位数逐渐下降，从12月开始贝莱斯芽孢杆菌养分消耗与枯枝落叶产生的养分相适应，成菌落单位稳定在6.8 × 106 CFU/g左右，约为最高菌量的52%。

由表2和图1可知，混在土中的哈茨木霉成菌落总数第一个月没有明显变化，第二个月出现大幅度下降，随后维持在3.3 × 107左右，约为初始菌落的29%。这可能是由于第一个月时哈茨木霉利用土壤养分增殖，增长与死亡平衡，菌量变化不大，而第二个月土壤养分消耗，哈茨木霉没有足够营养，所以菌体开始大量死亡，成菌落单位出现大幅下降，随后哈茨木霉在土壤中生长和繁殖消耗的养分和枯枝落叶逐渐产生的养分相适应，第3~第5个月时成菌落单位有缓慢增加，随后保持平稳波动。

贝莱斯芽孢杆菌最后的宿存率为50%，哈茨木霉最后的宿存率约为17.9%，表明混菌法中贝莱斯芽孢杆菌的宿存能力强于哈茨木霉。

3.3. 哈茨木霉及贝莱斯芽孢杆菌在大田土壤中的动态变化情况

大田试验后每月取土样检测，结果如表3和图3，图4所示。

Table 3. Changes of colony forming units of Trichoderma harzianum and Bacillus velezensis (field) 表3. 哈茨木霉及贝莱斯芽孢杆菌菌量变化情况(大田)

2019年 5月

6月

7月

8月

9月

10月 74667 1333

11月 60000 1900

12月 50000 2000