第六章 微生物的生长及其控制
微生物不论其在自然条件下还是在人为条件下发生作用，都是通过“以数取胜”或“以量取胜”。生长和繁殖就是保证微生物获得巨大数量的必要前提。微生物生长是指由于细胞成分的增加导致微生物的个体大小、群体数量或两者的增长。
个体细胞生长：细胞内组分的增加，导致细胞总量（体积、质量、大小）扩大的生物学过程。是逐渐发生的量变的过程。
个体繁殖：是微生物个体生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。是质变的过程。
由于微生物个体微小，以个体为对象研究其生长和繁殖十分不便，常以群体数量的变化来研究微生物的生长。在微生物学中，凡说“生长”一般均指群体生长，这与研究大型生物有所不同。
群体生长：指在一定时间和条件下，微生物细胞总量的增加。既有量变也有质变。
三者之间的关系：
个体生长 → 个体繁殖 → 群体生长 群体生长 ＝ 个体生长 ＋ 个体繁殖
第一节 测定生长繁殖的方法
测定生长的方法是以原生质含量的增加为基础，测定繁殖是建立在计算个体数目上。
一、测生长量
直接方法：测菌体细胞（数）量、菌体体积、菌体质量等；
间接方法：根据细胞内某种物质的含量或某种代谢活动强度间接测定。 （一）直接法 1、测体积
这是一种粗放的方法。将待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或离心沉降，观察其体积。
污泥沉降比（SV）：为含有污泥的混合液在量筒中静置30 min后所形成的沉淀污泥的容积占原混合液容积的百分数，以%表示。又叫30 min沉淀率。 该参数是评定活性污泥质量的重要指标之一。 正常范围为15-30%。
2、称重
此法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。包括称干重（DCW）和湿重。
将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来，经洗涤，再离心后直接称重，求出湿重。如果是丝状体微生物，过滤后用滤纸吸去菌丝之间的自由水，再称重求出湿重。
不论是细菌样品还是丝状菌样品，可以将它们放在已知重量的平皿或烧杯内，于105℃烘干至恒重，取出放入干燥器内冷却，再称量，求出微生物干重。微生物干重一般为其湿重的10%-20%。
以上都是液体培养时的称重法。
如果要测定固体培养基上生长的放线菌或丝状真菌，可先加热至50℃，使琼脂熔化，过滤得菌丝体，再用50℃的生理盐水洗涤菌丝，然后按上述方法求出菌丝体的湿重或干重。
（二）间接法
1、比浊法
采用分光光度计对微生物菌悬液进行测定，波长通常在450-650 nm之间。原理：细胞越多，浊度就越大，则分光光度计测量的光密度值（OD值）就越大。对于单细胞微生物，在一定范围内OD值与细胞总数成正比关系。
2、生理指标法
微生物生长过程中，生长量与很多生理指标相平行，可以通过测定细胞的含N、C、P、DNA量等间接计算。
原理：若某物质在各细胞中的含量一样，那么细胞构造中这种物质的总量就与总的微生物细胞量直接相关。 氮量测定法：
细菌 含氮量6.5%-13% 霉菌 含氮量4.5%-8.5% 酵母菌 含氮量7.5%左右
粗蛋白含量=含氮量×6.25
方法有：凯氏定氮法、Nessler法、过氯酸消化法等。 二、计繁殖数
对于繁殖来说，一定要计算微生物的个体数目，所以计繁殖数只适用于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子。
（一）直接法
直接法就是指在显微镜下直接观察细胞并继续计数的方法，所得的结果是包括死细胞在内的总菌数。
1、比例计数法
将已知颗粒浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，然后求出未知菌液中的细胞浓度。
2、血球计数板法
采用血球计数板测定一定体积中的细胞总数目的常规方法。测定中按统计学原理计数n格中微生物细胞数量，取平均值。
优点：此法容易、迅速、成本低、而且能观察细胞的大小和形态特征。 缺点：①样品中细胞数量不能太少；②无特别的技术就不能区分死活细胞。 鉴别死活细胞可以先进行染色处理。
原理：美蓝进入活细胞后，可被还原脱色，而死细胞及代谢缓慢的老细胞，无还原能力可被着色，借此可区分活菌和死菌。 （二）间接法：活菌计数法。
液体培养基变浑浊、固体培养基上（内）长菌落。菌落计数法最常用。 原理：活菌能在固体培养基上（内）形成菌落。 1、倾倒平板法/浇注平板法/混菌法
方法：取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在其凝固前（50℃左右）均匀混和。保温培养。
稀释平板计数时，在一个9cm直径的培养皿平板上，不同种类微生物的稀释度计数标准是：
细菌：50-500个菌落；放线菌：30-300个菌落；真菌：10-100个菌落 CFU PFU 菌落计数器
从平板上（内）出现的菌落数乘上菌液的稀释度，即可计算出原菌液中含有的活菌数（一个菌落来源于一个活细胞）。
2、涂布平板法
a—将少量样品加到已凝固的琼脂平板中央；b—将玻璃三角棒浸入酒精；c—将蘸有酒精的涂布棒在火焰上灼烧后冷却；d—均匀涂布后适当条件下培养
方法：取一定体积的稀释菌液，涂布于已凝固的固体培养基平板上。保温培养。从平板上出现的菌落数乘上菌液的稀释度，即可计算出原菌液中含有的活菌数（一个菌落来源于一个活细胞）。
3、滤膜培养法
方法：使样品滤过一种特制的，孔径小于细菌个体的滤膜，然后将滤膜置于培养基上或浸润有液体培养基的垫状物上培养，通过计算在滤膜上形成的菌落数就可知样品中的活菌数。
第二节 微生物的生长规律
一、微生物的个体生长和同步生长 1、微生物的个体生长
细菌的个体生长包括细胞结构的复制与再生、细胞的分裂与控制。在整个生长过程中，微小的细胞内发生着阶段性极其复杂的生物化学变化和细胞学变化。研究这一变化，目前使用的方法有两种：一是用电子显微镜观察细胞的超薄切片；二是使用同步培养技术。
2、微生物的同步生长
在分批培养中，细菌群体能以一定速率生长，但所有细胞并非同时进行分裂。也就是说，培养中的细胞不处于同一生长阶段，它们的生理状态和代谢活动也不完全一样。显然，如果以群体测定结果的平均值代表单个细胞就必须设法使群体处于同一发育阶段，使群体和个体行为变得一致，因而发展了单细胞的同步培养
第六章微生物的生长及其控制
