南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2020，51（5）：1091-10975期2095-1191；ISSNCODENNNXAABhttp://www.nfnyxb.com·1091·DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2020.05.013荔枝泛素结合酶基因（LcUBC12）的生物信息学
及表达特性分析
董
晨，魏永赞，王
弋，郑雪文，李伟才，石胜友
524091）
（中国热带农业科学院南亚热带作物研究所/农业农村部热带果树生物学重点实验室，广东湛江
摘要：【目的】分析荔枝泛素结合酶（E2）基因（LcUBC12）的生物学信息，并检测其组织表达特异性及烯效唑处理下花穗不同发育阶段中的表达情况，为研究E2响应烯效唑的作用机制及泛素化修饰在调控荔枝花穗发育中的功能提供理论依据。【方法】以从妃子笑荔枝花穗转录组（RNA-seq）数据中筛选出的LcUBC12基因为参考序列，利用本地BLAST从荔枝基因组中查找出该基因cDNA全长（Litchi_GLEAN_10004716），并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测LcUBC12基因在妃子笑荔枝不同组织及烯效唑处理下花穗不同发育阶段的表达情况。【结果】LcUBC12基因cDNA全长519bp，编码172个氨基酸，其编码的蛋白分子量19.68kD，等电点6.52，不稳定指数35.70，亲水性的平均值-0.734，为亲水稳定蛋白，定位于细胞核，不存在信号肽和跨膜结构，包含典型的UBC12保守结构域，属于ClassI家族E2蛋白，二级结构以无规则卷曲为主。LcUBC12蛋白与向日葵（XP_022009656.1）、柑橘（XP_006466720.1）、草莓（XP_004300599.1）和萝卜（XP_018466680.1）等UBC12蛋白的氨基酸序列同源性较高，分别为70.11%、68.16%、67.76%和67.03%。LcUBC12蛋白与芸香科的柑橘UBC12亲缘关系最近，其次是与同属菊科的向日葵和莴苣UBC12蛋白亲缘关系较近。LcUBC12基因在不同组织中表达量排序为雌花>雄花>种子>果皮>叶>茎>根>果肉。烯效唑处理0~21dLcUBC12基因在花穗中的表达量与对照无明显差异，烯效唑处理28d其表达量明显低于对照，但烯效唑处理35d其表达量上调，且较对照高。【结论】LcUBC12基因具有组织表达特异性，在妃子笑荔枝雌花、雄花和种子中高效表达，推测其主要在花穗发育和生殖生长过程中发挥重要调控作用，但烯效唑处理后LcUBC12基因对花穗发育发挥负调控作用。
关键词：荔枝；妃子笑；泛素结合酶；基因；实时荧光定量PCR；生物信息学；花穗发育；组织表达中图分类号：S667.103.6
文献标志码：A
文章编号：2095-1191（2020）05-1091-07
BioinformaticsandexpressioncharacteristicsanalysisofLitchichinesisSonnubiquitin-conjugatingenzymegene（LcUBC12）
DONGChen，WEIYong-zan，WANGYi，ZHENGXue-wen，LIWei-cai，SHISheng-you
（InstituteofSouthSubtropicalCorpResearch，ChineseAcademyofTropicalAgriculturalScience/KeyLaboratoryof
TropicalFruitBiology，MinistryofAgricultureandRuralAffairs，Zhanjiang，Guangdong524091，China）Abstract：【Objective】Biologicalinformationofubiquitin-conjugatingenzyme（E2）gene（LcUBC12）inlitchiwasana-lyzed，andtheexpressionpatternspecificityandtheexpressionofLcUBC12werestudiedindifferentstagesoflitchiinflo-rescencesunderuniconazoletreatment.TheresultscouldprovidedatheoreticalbasisforstudyingthemechanismofE2re-sponsetouniconazoleandthefunctionofubiquitinationmodificationinregulatingthedevelopmentofFeizixiaolitchiin-florescences.【Method】WithLcUBC12genescreenedfromthetranscriptomedataoftheFeizixiaolitchiinflorescences
（RNA-seq）asreferencesequence，thefull-lengthcDNAofLcUBC12wasobtainedbylocalBLASTtofindthelitchige-nome（Litchi_GLEAN_10004716）.Real-timefluorescencequantitativePCR（qRT-PCR）wasusedtoanalyzetheexpressionofFeizixiaolitchiLcUBC12indifferenttissuesandatdifferentdevelopmentalstagesofinflorescencewhichweretreatedbyuniconazole.【Result】ThecDNAofLcUBC12genewas519bpinlength，encoding172aminoacidswithamolecularweightof19.68kDandanisoelectricpointof6.52，andtheinstabilityindexwas35.70，theaveragehydrophilicvaluewas-0.734，whichwasahydrophilicstableprotein.Thepredictedsubcellularlocalizationwasinthenucleus.Therewas收稿日期：2019-07-15基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务专项（1630062016006）；国家荔枝龙眼产业技术体系项目（CARS-33-21）作者简介：董晨（1981-），副研究员，主要从事果树生物学研究工作，E-mail：hysdongchen@sina.com
·1092·南方农业学报51卷nosignalpeptideandtransmembrane.ThestructurecontainedatypicalconservedUBCdomain.ItbelongedtoClassI
familyE2protein，thesecondarystructureoftheproteinwasmainlyrandomcoiling.NCBIblastanalysisindicatedthehomologyofUBC12proteinaminoacidsequenceofLcUBC12aminoacidsequencewithsunflower（XP_022009656.1），citrus（XP_006466720.1），strawberry（XP_004300599.1）andradish（XP_018466680.1）werehigh，whichwere70.11%，68.16%，67.76%and67.03%，respectively.PhylogeneticanalysisindicatedthatLcUBC12proteinwastheclosesttocitrusUBC12ofRutaceaeandalsohadcloserelationshipwithsunflowersandlettuceoftheCompositae.qRT-PCRanalysisindi-catedtheexpressionofLcUBC12geneindifferenttissueswasfemaleflower>maleflower>seed>peel>leaf>stem>root>pulp.Theexpressiontreatedbyuniconazoleat28dwaslowerthanthatincontrol，howevertheexpressionat35dup-regu-latedintreatmentandwashigherthanthatincontrol.【Conclusion】TheLcUBC12genehastissueexpressionspecificityandisabundantlyexpressedinFeizixiaolitchifemaleflowers，maleflowersandseeds.Itisspeculatedthatitmainlyplaysanimportantroleintheinflorescencesdevelopmentandreproductivegrowthoflitchi，butLcUBC12geneplaysanegativeregulatoryroleininflorescencesdevelopmentafteruniconazoletreatment.
Keywords：litchi；Feizixiao；ubiquitin-conjugatingenzyme；gene；real-timefluorescencequantitativePCR；bioin-formatics；inflorescencesdevelopment；tissueexpressionFoundationitem：BasicScientificResearchProjectofCentralPublicWelfareResearchInstitutes（1630062016006）；NationalLitchiandLonganIndustrialTechnologySystemProject（CARS-33-21）
0引言
【研究意义】泛素化蛋白酶体途径是一种真核生物蛋白质翻译后的修饰途径。在该途径中，泛素主要通过泛素蛋白酶与靶蛋白结合形成一条多泛素链，将底物蛋白泛素化，使靶蛋白被26S蛋白酶所识别并降解（Ciechanoveretal.，2000；Pickart，2001）。在泛素化过程中，泛素与靶蛋白的结合需要3种酶参与，分别为泛素激活酶（Ubiquitin-activatingenzyme，E1）、泛素结合酶（Ubiquitin-conjugatingenzyme，E2）和泛素蛋白连接酶（Ubiquitinligase，E3）。泛素化过程涉及三步酶促级联反应：首先E1激活泛素分子，然后被激活的泛素分子连接到E2上，E3结合目标蛋白并促进E2将激活的泛素分子转移到目标蛋白上，最终实现目标蛋白的泛素化（Kerscheretal.，2006）。可见，E2作为植物蛋白泛素化降解途径中的关键酶，包含典型的UBC保守结构域，长约140~200个氨基酸，在植物生长发育过程中发挥重要作用（Cuietal.，2012）。因此，本研究通过克隆荔枝发育花和果实中的E2基因，研究其编码蛋白生物学信息及表达特性，对其在荔枝坐果中的生物学功能研究具有重要意义。【前人研究进展】目前，E2基因的研究主要集中在对DNA的修复进程和抗逆响应（王金利等，2010），在调控花和果实发育方面研究较少（Wangetal.，2014）。Picton等（1993）首次从番茄中克隆到E2基因，研究发现其在番茄叶片衰老和果实成熟过程中表达。王园等（2010）从香蕉采后早期抑制差减文库中筛选得到E2基因（MaUCE1），研究发现MaUCE1基因可调控香蕉果实成熟过程中淀粉酶活性或含量，在香蕉果实成熟的分解代谢中发挥作用。
Li等（2013）通过研究荔枝早期果实发育遮阴处理差异基因表达发现，遮荫处理下UBCE2基因表达量上调，高于对照的表达量，推测遮阴处理对UBCE2基因表达发挥正向诱导作用。Wang等（2014）研究发现，番茄中2个E2基因（SlUBC32和SlUBC41）参与调控番茄果实成熟，但具体分子调控机制尚不清楚。Dong等（2016）通过研究香蕉花后果实不同发育阶段E2基因家族的表达情况发现，E2基因家族不同成员在果实发育不同阶段行使功能，推测这些基因在果实发育过程中发挥关键作用。陈曙等（2018）通过研究低磷处理下玉米幼苗不同组织中E2基因的表达情况发现，ZmUBC17基因具有组织表达特异性，在叶片中大量表达，推测ZmUBC17基因是通过调控玉米对磷元素吸收和转运间接影响光合作用效率。
Nurdiani等（2018）研究发现，水稻OsSCE1基因（LOC_Os10g39120）在日本晴中过表达从而降低了植株对干旱胁迫的耐受性，而敲除OsSCE1基因后其耐旱性略升高，表明该基因可能在水稻干旱胁迫中起到负调节作用。【本研究切入点】目前鲜见有关妃子笑荔枝花穗发育过程中E2基因（LcUBC12）表达的相关研究报道。【拟解决的关键问题】基于本课题组前期烯效唑处理的荔枝花穗发育转录组（RNA-seq）数据，从中筛选出LcUBC12基因，利用本地BLAST从荔枝基因组中查找出该基因cDNA全长，并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测LcUBC12在妃子笑荔枝不同组织及烯效唑处理下花穗不同发育阶段的表达情况，分析该基因在调控妃子笑荔枝花穗发育中的作用，为研究E2响应烯效唑的作用机制及泛素化修饰在调控妃子笑荔枝花穗发育中的功能提供理论依据。
5期董晨等：荔枝泛素结合酶基因（LcUBC12）的生物信息学及表达特性分析
·1093·1材料与方法
1.1
试验材料
试验材料为妃子笑荔枝，种植于中国热带农业科学院南亚热带作物研究所荔枝栽培示范园。主要试剂：植物总RNA提取试剂盒（北京华越洋生物科技有限公司）、cDNA反转录试剂盒（ThermalFisherScientific公司）和SYBRPremixExTaqTM荧光定量PCR试剂盒［宝生物工程（大连）有限公司］。主要仪器设备：实时荧光定量PCR仪（罗氏LightCycler，北京龙跃生物科技发展有限公司）。1.2样品采集及处理
采集妃子笑荔枝的根、茎、叶、雌花、雄花、果肉、果皮和种子等组织。此外，随机选择树龄相同、长势相近的妃子笑果树6株，当花穗抽生至约18cm时，对整个树冠喷施50mg/L烯效唑（有效成分含量5%），喷至叶面滴水，对照不作任何处理。完全随机区组排列，单株小区，3次重复。追踪花穗和果实发育动态，分别在0、7、14、28、35和42d取花穗样品，用液氮速冻后于-80℃保存，用于后续RNA提取。1.3生物信息学分析
基于妃子笑花穗RNA-seq数据（GenBank登录号SRP092890）（Weietal.，2017），筛选获取荔枝LcUBC12基因转录本，利用本地BLAST查找荔枝基因组中该基因的cDNA序列全长，对其编码蛋白LcUBC12）进行生物信息学分析：利用ExPASyProtParam和ProtScale预测其基本理化性质、Plant-mPLoc进行亚细胞定位、SMART预测保守结构域、SOPMA预测二级结构、SignalP4.1Server预测信号肽、ExPASyTMPred预测跨膜结构及NetPhos分析磷酸化位点。此外，利用NCBI数据库中的BLAST将LcUBC12蛋白氨基酸序列与其他物种的E2蛋白进行同源性比对。利用Clustalx1.83进行多重序列比对。采用MEGA6.0的邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育进化树（1000次重复，其他参数均为默认）。1.4qRT-PCR检测
参照植物总RNA提取试剂盒说明提取样品的总RNA，用RNase-freeDNase消化去除DNA污染，利用核酸蛋白检测仪检测RNA质量和浓度。利用M-MLV逆转录酶反转录合成cDNA第一链。利用Pri-mer3plus设计LcUBC12基因的qRT-PCR引物（F：5'-AGCCGGGGAATTACGTCTTA-3'；R：5'-ACCGTTGTCTTGCACTTAACC-3'）和内参基因（GenBank登录号HQ615689）引物（F：5'-GTGGTTCTACTATGTTCCCTG-3'；R：5'-CTCGTCGTACTCATCCTTTG-3'），委托广州艾基生物技术有限公司合成。qRT-PCR反应体系20.0μL：cDNA1.0μL（相当于25ng总
RNA），10μmol/L上、下游引物各2.0μL，2×SYBRPremixExTaqTM10.0μL，ddH2O（无RNA酶）补足至20.0μL。扩增程序：94℃预变性2min；94℃15s，58℃30s，72℃30s，共进行40个循环。每个样品设3次重复。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，以根和处理0d花穗为对照。1.5统计分析
利用Excel2016进行数据处理，SigmaPlot作图。
2结果与分析
2.1LcUBC12蛋白基本理化性质分析及亚细胞定位结果
从烯效唑处理的妃子笑花穗RNA-seq数据中筛选获取荔枝LcUBC12基因转录本（Unigene0021028），通过本地BLAST从荔枝基因组中获得该基因cDNA的核苷酸序列全长，该基因编号为Litchi_GLEAN_10004716，将其命名为LcUBC12。该基因在基因组中编码区序列（CDS）全长为519bp，编码172个氨基酸，其编码蛋白的分子量19.68kD，分子式C879H1363N237O260S8，等电点6.52，不稳定指数35.70，为稳定蛋白，脂肪指数70.23，亲水性的平均值为-0.734，存在明显的疏水区和亲水区，疏水氨基酸的最大值1.311）小于亲水性氨基酸的最大值（-2.944），且亲水性氨基酸总数为127个，比疏水性氨基酸总数（36个）多，为亲水蛋白（图1）。LcUBC12蛋白亚细胞定位于细胞核。
2.2LcUBC12蛋白跨膜结构及信号肽预测
利用TMPred对LcUBC12蛋白进行跨膜结构预测分析，结果（图2）表明，LcUBC12蛋白不存在跨膜
ProtScaleouttputforuser_sequence
1.51.00.50.0ero-0.5cS-1.0-1.5-2.0-2.5-3.0
20
40
60
80
100120
140160
Position
图1LcUBC12蛋白疏水性/亲水性分析结果
Fig.1LcUBC12proteinhydrophobicity/hydrophilicityanaly-sis
（（
荔枝泛素结合酶基因（LcUBC12）的生物信息学<p>及表达特性分析</p><p><br/></p>
