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原料药中有机杂质研究与控制——综述
1.1 前言
随着公众和媒体对药物安全性的日益关注，控制药物中的杂质已成为药品质量控制中的重要问题。人用药品注册技术要求国际协调会(ICH)已经制定了与杂质控制相关的切实可行的指导原则[1]，其基本理念已经逐步被国际社会接受。目前，英国药典(BP)[2]、欧洲药典(EP)[3]和美国药典(USP)[4]均在附录中设有专门的杂质检查通则；中国药典(ChP) [5]二部从ChP(2005)开始，附录中开始设有“药物杂质研究指导原则”；2005年国家食品药品监督管理局(SFDA)发布了《化学药物杂质研究的技术指导原则》[6]；之后，2007年又颁布了《药品注册管理办法》，在药品注册审评过程中，对药品中的杂质评价都予以高度重视，极大地促进了药品质量的提高。
1.2 原料药中杂质控制理念的变迁
原料药(化学药物)中所含有的杂质，按照《化学药物杂质研究技术指导原则》定义是指任何影响药物纯度的物质。其杂质一般分为三类：有机杂质、无机杂质和残留溶剂，是包括工艺中引入的杂质和降解产物。无机杂质是指在原料药及制剂生产或传递过程中产生的杂质，包括：反应试剂、配位体、催化剂、重金属、无机盐等。残留溶剂是指在原料药及制剂生产过程中使用的有机溶剂。对于无机杂质和残留溶剂，各国药典都收载了经典、简便、有效的检测方法，故可采用药典的相关方法对其进行控制。而有机杂质因其化学结构一般与活性成分类似或具渊源关系，故又称为有关物质。由于有机杂质其产生的途径与工艺流程密切相关，且可能产生毒副作用，从而给原料药本身在药物使用的安全性和有效性方面带来诸多影响，所以各国药品监督部门在对原料药的质量标准制定上，均对有机杂质的控制予以高度重视，并随着新测试仪器的开发利用、分析技术水平的提高，不断地对有机杂质的分析与控制提出更高的要求。下文中所提“杂质控制”均指有机杂质的控制。
追溯人们对药品中杂质控制理念的变迁，可概括为三个主要阶段：主成分纯度控制阶段、非确定性杂质限度控制阶段和确定性杂质定量限度控制阶段。
早期的药物质量控制主要基于容量法、分光光度法等经典的化学分析方法
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，对杂质的控制主要是通过对测定与药品的主成分纯度相关的特征物理化学指标控制间接实现的，如测定双醋炔诺醇的紫外光谱中236nm处的吸收值，当加入3,5-双烯杂质时，此处吸光值会随着杂质量的增加而增大。此阶段，由于分析方法的局限性不能将杂质与主成分有效分离，对杂质的控制能力是极其微弱的，达不到定性与定量的水平。Johnson CA[7]撰文综述了1986年前20~30年间BP的一般质控策略及新分析方法(HPLC、GC)对BP的影响。虽然BP(1980)已经提出了有关物质(related substances)的概念，但此期间对药品质量的控制主要为对药品主成分纯度的控制。
进入20世纪90年代，伴随着色谱分析技术的飞速发展，对化学药品中的杂质分析成为当时药品质控分析研究的主流。在药品质量控制理念方面，BP(1988)已明确，“与已知杂质相比，对药品中的未知(潜在)杂质的控制更为重要；在良好的药品生产条件下，药品中不应当出现性质未知和量不可控的杂质”。从BP(1988)起，历版的BP逐渐增加了对各类化学药品有关物质的检查；BP(1998)是药物杂质控制的重要“分水岭”，该版药典在附录中首次增加了有关物质和残留溶剂检查通则，增加了杂质控制指导原则；同时在各论中对化学药品的已知杂质给出了具体的名称、分子式和结构式，并通过“已知杂质”、“任意单个杂质”和“总杂质”实现对化学药品中杂质的控制；标志着对药品中杂质的“限度控制”理念已经成熟。ChP(2000)和ChP(2005)均遵循该“限度控制”理念控制化学药品中的杂质。
进入21世纪，伴随着人们对药品中的杂质特性，特别是生物学特性的深入了解，发现不同的杂质可能具有完全不同的生理活性，如β-内酰胺抗生素中的微量聚合物杂质可能导致过敏反应，“致突变杂质”与其他杂质相比对人体的危害更大，仅用“限度控制”杂质总量和非确定的单个杂质的控制方式，是无法实现针对此类“致敏、致突变类”杂质进行定量控制的目的。此时药品的“非确定性杂质限度控制”理念暴露出明显缺陷。药品中的诸杂质的种类与相应含量被总称为杂质谱或杂质概况(impurity profiles)。理想的控制理念应是针对药品中的每一个杂质，依据其生理活性逐一制定其质控限度。1997年，GorogS等[8]撰文较详细地阐述了利用杂质谱控制药品中杂质的策略，并以甲哌地强龙(mazipredone)为例，提出了利用色谱(TLC、HPLC、GC)、光谱(UV、NMR)和联用技术(HPLC-PDA，GC-MS，HPLC-MS)组合分析药品杂质谱的方法。之后，药品“杂质谱控制”的理念逐渐形成。ChP(2010)中的部分化学药品已开始尝试利用杂质谱控制的理念进行杂质控制。
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1.3 原料药杂质谱研究与控制的意义
原料药杂质谱研究与控制具有如下的重要意义：
首先，杂质谱的研究有助于对原料药合成工艺进行有效监控，从而保证原料药生产流程的质量稳定性。原料药杂质(有关物质)可能是在原料药生产过程中带入的起始原料、试剂、中间体、副产物和异构体等物质，也可能是在生产、贮藏和运输过程中产生的降解产物、聚合物或晶型转变等特殊杂质[9]。同一种原料药由于合成路线和合成工艺的不同而会产生多种不同杂质，而其中的一些杂质的产生是与特定的合成路线和合成工艺密切相关的，这类杂质又称为合成路线标记杂质，它们的生成量的大小往往取决于合成路线和合成工艺中关键控制参数的优化水平、以及日常生产稳态控制水平，它们当中在含量与种类上的微小变动都可能是药物在合成工艺过程中的某些因素的改变(甚至是较大幅度的变更)所造成的
[10]
。对原料药杂质谱进行研究与控制，通过对比同一厂家不同时期的生产批中杂
质的种类与数量关系，可了解厂家在不同阶段工艺改进与参数优化方面的变更情况；对近期连续生产批中杂质谱进行种类数量分布统计，以此为指标可动态反映当前阶段生产工艺控制水平；而对不同厂家生产的同种原料药中杂质谱的比较，则不仅反映出产品质量在杂质控制水平上的差异，还可反映出产品在合成工艺上的差异性。此外，原料药杂质谱研究在合成工艺专利保护上还有特殊意义，由于合成路线标记杂质，与特定的合成路线具有唯一的确认关系，有些在合成工艺上取得专利的原料药厂商，为保护自身利益，通过对比其它厂家同一产品杂质谱，以是否存在合成路线标记杂质作为依据，来判定其它厂家是否有盗用专利合成工艺的侵权行为[11]。
其次，杂质谱的研究为原料药进一步进行毒理学安全评价、药理学临床研究、药剂学研究提供数据参考。《化学药物杂质研究的技术指导原则》规定了原料药杂质限度(见表1-1)的要求，定义了三类杂质限度：
报告限度(Reporting Threshold)：超出此限度的杂质均应在检测报告中报告，并应报告具体的检测数据。
鉴定限度(Identification Threshold)：超出此限度的杂质均应进行定性分析，确定其化学结构。
质控限度(Qualification Threshold)：质量标准中一般允许的杂质限度，如制订的限度高于此限度，则应有充分的依据。
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表1-1 原料药杂质限度
每日最大剂量 报告限度 ≤2g/day >2g/day
当原料药存在化学结构相近的杂质(有关物质)且含量超过鉴定限度或界定限度时，药物研发者有义务对杂质的安全性进行评价。如果可以降低杂质含量至质控限度以下，或者通过研究文献资料可以提供杂质安全性证据的，可以免于杂质的安全性评价。否则，必须进行杂质毒性(包括遗传毒性)实验，评价杂质可能产生的毒副作用。具体研究方法可以采用含有一定杂质的样品(杂质量可能与临床研究用样品不同，但杂质种类和个数应该一致)在啮齿类和非啮齿类动物进行急性毒性试验和长期毒性试验，确定原料药的NOEL(No Observed Effect Leve，不能观察到反应的量)或LOEL(lowest observed effect level即能观察到反应的最低量)，从而计算出每日可接受的最大摄入量(PDE，permitted daily exposure)。
因此，在对原料药杂质进行毒性(包括遗传毒性)实验前，必须提供该原料药杂质谱的研究数据，并且要求临床研究用样品的杂质量不得高于毒性试验研究用样品的杂质量。如果合成工艺发生较大的变更，终产品的杂质种类和数量均发生变化，则需要重新进行杂质的毒性研究，确定新杂质的PDE值。
同时原料药杂质谱研究也为进一步药剂学研究开发，提供了初期药物稳定性数据。原料药的杂质可能是工艺过程产生的杂质和生产储存过程中自身降解物。对原料药进行初期药物稳定性试验(加速试验、强制降解试验)，通过对比试验样品与空白试验样品中的杂质谱，可分清楚哪些杂质是由工艺生产带进(此类杂质在稳定性试验中含量无显著改变)，哪些杂质是由降解产生的(此类杂质在稳定性试验中含量显著改变)。原料药的降解产物对于剂型选择、处方组成、剂型工艺确定、以及剂型产品的储存方式等均产生较大的影响。通过对初期药物稳定性试验样品中降解杂质谱进行分离，并进行结构确证，可了解原料药降解杂质基本组成以及产生的原因，为剂型药中杂质的定性、定量分析提供实验准备，所以原料药杂质谱研究应是药品质量研究、质量控制和安全性研究的基础。
>0.05% >0.03%
鉴定限度
>0.10%
or 1.0mg/day(取最小值) >0.05%
界定限度
>0.15%
or 1.0mg/day(取最小值) >0.05%
1.4 原料药杂质谱中的杂质结构分析基本步骤
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目前，杂质结构定性研究仍是国内有关物质研究中的薄弱环节，在一定程度上限制了我国药品研究水平和药品质量的提高。由于各研究机构采用的分析方法手段不同，使用仪器设备的差异，以及不同原料药的特性差异，导致各研究机构对不同原料药杂质谱研究的步骤会有所差异。但有关物质结构研究的途径还是有迹可循的(见图1-1)[9]。
图1-1原料药杂质结构分析的步骤
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原料药中有机杂质研究与控制
