《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research
Wnt信号通路调控角膜缘干细胞治疗角膜缘干细胞缺乏症 韩 波，杨 喆，栗 静，张明昌(华中科技大学同济医学院附属协和医院眼科，湖北省武汉市 430022) DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2028 ORCID: 0000-0003-0698-3653(韩波)
文章快速阅读：
文章创新— (1) 文献报道Wnt信号通路在维持多种干细胞特性中起重要作用，并参与调控干细胞分化，但Wnt 信号通路是否能对角膜缘干细胞的细胞特性及分化产生重要的调控作用尚无更多信息支持； (2)通过氯化锂激活Wnt信号通路，研究其对角膜缘干细胞的调控作用，发现Wnt信号通路激活可使 得角膜缘干细胞进入自我更新状态； (3)建立大鼠角膜缘干细胞缺乏症模型，以结膜下注射的方式给予Wnt信号通路激活的角膜缘干细胞，发现有明显的治疗效果。 实验组： PCR检测p63α、CK12、 大鼠角膜培养液中加入氯化Ki-67、CEBPδ的表达 结论： 缘干细胞锂 (1)Wnt信号通克隆形成实验 路激活使得 培养 对照组： 角膜缘干细 常规培养液 免疫荧光检测β-catenin胞进入自我 的表达 更新状态； (2)自我更新状裂隙灯、荧光染色观察 治疗组： 态的角膜缘结膜下注射上述实角膜组织 干细胞在角 大鼠角膜缘干细胞验组角膜缘干细胞 膜缘干细胞 缺乏症模 角膜石蜡切片苏木精-缺乏症的治 型 对照组： 伊红染色 结膜下注射等量 疗中能发挥免疫荧光检测角膜组织显著作用。 PBS β-catenin的表达 文题释义：
Wnt信号通路：Wnt信号通路是一条高度保守的信号通路，在干细胞调控中发挥重要作用。当细胞外Wnts与细胞膜上特异性受体Frizzled蛋白结合导致GSK3β失活，β-catenin在胞质中积累继而向胞核转位，标志着Wnt通路被激活。β-catenin在细胞核中与转录因子Tcf /LEF结合启动下游基因而发挥功能。
角膜缘干细胞：角膜缘为角膜和结膜、巩膜交界部分，角膜缘干细胞存在于角膜缘的Vogt栅栏结构中，属于单能干细胞，在角膜损伤修复中发挥重要作用。角膜缘干细胞缺乏是由于眼表各类损伤(化学伤、严重的感染等)或者基质微环境异常(先天性无虹膜、放射线所致角膜病)导致角膜上皮被结膜上皮侵犯和替代。
摘要
背景：Wnt信号通路在干细胞的调控中发挥重要作用，但是其对于角膜缘干细胞的调控作用尚不十分明确。 目的：探讨Wnt信号通路对角膜缘干细胞的调控作用及其在角膜缘干细胞缺乏症治疗中的疗效。
方法：大鼠角膜缘组织中依次加入Dispase和Trypsin/EDTA进行消化，将消化后的角膜缘干细胞悬液接种于3D-Matrigel微环境中培养，实验组培养体系中加入Wnt信号通路激活剂氯化锂(500 μmol/L)，对照组不加氯化锂，培养第7天qRT-PCR检测角膜缘干细胞中p63α、CK12、CEBPδ和Ki67的表达，免疫荧光染色检测角膜缘干细胞中β-catenin的表达。采用碱烧伤法建立大鼠角膜缘干细胞缺乏模型，治疗组大鼠结膜下注射激活了Wnt信号通路的角膜缘干细胞，对照组大鼠结膜下注射等量PBS，随后每天使用裂隙灯观察，治疗后第4天取角膜缘组织进行免疫荧光染色、苏木精-伊红染色。 结果与结论：①角膜缘干细胞在3D-Matrigel培养微环境中呈球形聚集生长，对照组角膜缘干细胞中β-catenin呈阴性，实验组角膜缘干细胞中β-catenin在细胞浆和细胞核内聚集；②qRT-PCR结果显示：对照组与实验组之间干性指标p63α、CK12和功能指标CEBPδ差异均无显著性意义(P > 0.05)；实验组增殖指标Ki-67较对照组水平明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)；③建立大鼠角膜缘干细胞缺乏模型，治疗组大鼠角膜组织混浊评分较对照组明显减低，差异有显著性意义(P < 0.05)，角膜组织苏木精-伊红染色可见治疗组大鼠角膜上皮细胞排列整齐，细胞大小较均一，修复情况较良好，免疫荧光结果显示治疗组大部分角膜上皮细胞中β-catenin在细胞浆以及细胞核内聚集，而对照组角膜上皮细胞中β-catenin仅是弱阳性，未见在胞浆聚集或者进核；④结果表明，Wnt信号通路的激活增强了角膜缘干细胞的增殖能力，同时能够维持细胞干性，角膜缘干细胞进入干细胞自我更新状态；激活Wnt信号通路后的角膜缘干细胞可促进角膜缘干细胞缺乏模型大鼠角膜上皮的修复，减轻角膜混浊程度；通过调控Wnt信号通路改变角膜缘干细胞的功能特性可能成为治疗角膜缘干细胞缺乏症的新途径。 关键词：
Wnt信号通路；角膜缘干细胞；角膜缘干细胞缺乏症；自我更新
·研究原著·
韩波，女，1977年生，湖北省武汉市人，汉族，2007年华中科技大学毕业，博士，主要从事角膜病、青光眼、白内障研究。
通讯作者：韩波，博士，华中科技大学同济医学院附属协和医院眼科，湖北省武汉市 430022
文献标识码:B
来稿日期：2019-07-10 送审日期：2019-07-22 采用日期：2019-08-23 在线日期：
2019-11-25
Han Bo, MD, Department of Ophthalmology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China
Corresponding author: Han Bo, Department of Ophthalmology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China
1057
韩波，杨喆，栗静，张明昌. Wnt信号通路调控角膜缘干细胞治疗角膜缘干细胞缺乏症[J]. 中国组织工程研究，2020，24(7):1057-1062. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2028
中图分类号：R459.9；R394.2；R772.2 基金资助：
国家自然科学基金(81400378)，项目负责人：韩波
Regulation of limbal stem cells via Wnt signaling in the treatment of limbal stem cell deficiency
Han Bo, Yang Zhe, Li Jing, Zhang Mingchang (Department of Ophthalmology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China)
Abstract
BACKGROUND: Wnt signaling pathway plays an important role in the regulation of stem cells, but its regulatory effect on limbal stem cells is not well defined.
OBJECTIVE: To investigate the regulation of limbal stem cells via Wnt signaling pathway and its function in the treatment of limbal stem cell deficiency.
METHODS: Rat limbal segments were digested with Dispase and trypsin/EDTA and then single limbal stem cells were seeded in 3D-Matrigel. In experimental group LiCl (500 μmol/L) was added to the culture system. Control group received no LiCl. The expression levels of p63α, CK12, CEBPδ and Ki67 in limbal stem cells were detected by qRT-PCR on the 7th day of culture. The expression level of β-catenin in limbal stem cells was detected by immunofluorescence staining. The rat model of limbal stem cell deficiency was made by alkali burn method. Rats in treatment group were treated with Wnt-activated limbal stem cells by subconjunctival injection. Rats in control group were treated with PBS. Rats were checked by slit lamp every day. On the 4th day after treatment, the immunofluorescence staining and hematoxylin-eosin staining were applied to evaluate the repair of limbus.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The limbal stem cells aggregated in 3D-Matrigel. β-Catenin was negative in the control group. β-Catenin was found in the cytoplasm and nucleus of the limbal stem cells in the experimental group. (2) qRT-PCR results showed there was no significant difference in the levels of p63α, CK12 or CEBPδ between control and experimental groups (P > 0.05). The Ki67 level in the experimental group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). (3) The rat models of limbal stem cell deficiency were established. The degree of corneal opacity in the treatment group was significantly lower than that in the control group (P < 0.05).
Hematoxylin-eosin staining results observed that the corneal epithelial cells in the treatment group were neatly arranged, the cell size was uniform, and repair was good. Immunofluorescence staining showed that β-catenin was found in the cytoplasm and nucleus of most corneal epithelial cells in the treatment group. While β-catenin was only weakly positive in the control group, and was invisible in the cytoplasm or nucleus. (4) These results indicate that activation of Wnt signaling pathway in limbal stem cells enhances their proliferation and keeps them in an undifferentiated self-renewal state. Wnt-activated limbal stem cells can promote the regeneration of corneal epithelium and reduce the degree of corneal opacity in the treatment of limbal stem cell deficiency. The regulation of limbal stem cells via Wnt signaling pathway is expected to provide new ideas for the treatment of limbal stem cell deficiency.
Key words: Wnt signaling pathway; limbal stem cells; limbal stem cell deficiency; self-renewal Funding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81400378 (to HB)
0 引言 Introduction
干细胞是一群具有自我更新和多向分化潜能的原始细胞[1]，通常以静止和激活2种状态存在于机体内[2]，通过自我更新和定向分化从而维持组织细胞的动态平衡。角膜缘干细胞(limbal stem cells，LSCs)位于角膜缘上皮基底层的特殊结构“Vogt栅栏”处[3]，属于单能干细胞，其增殖和移行对于维持角膜上皮的完整和正常功能至关重要[4]。临床上角膜直接损伤或者角膜干细胞微环境破坏都有可能导致角膜缘干细胞缺乏(limbal stem cells deficiency，LSCD)的发生，例如化学烧伤、长时间使用角膜接触镜[5]、先天性无虹膜等[6]。现阶段临床上角膜缘干细胞缺乏症的治疗方法仍以手术为主，虽然以细胞为基础的治疗策略被推荐用于角膜缘干细胞缺乏症的治疗[7-8]，但是其远期效果并不明确[9]，仍然是棘手的医学难题。现阶段大家之所以热衷于将干细胞用于角膜缘干细胞缺乏症的治疗，主要是由于角膜干细胞能通过自我更新、定向分化从而修复角膜，远期效果不明确主要是干细胞在自我更新、定向分化中的调控机制尚未完全研究清楚。对于角膜缘干细胞信号通路的研究或许能够为解决角膜缘干细胞缺乏症的治疗难题提供理论基础和新的思路[10]。
Wnt信号通路经典途径是以β-catenin作为核心分子完
1058
成信号转导[11]，在多种干细胞的增殖和分化中起到至关重要的调节作用[12]。该研究通过在角膜缘干细胞培养体系中加入氯化锂激活Wnt信号通路从而研究Wnt信号通路对角膜缘干细胞干性及功能的影响[13]，为解决角膜缘干细胞缺乏这一难题提供理论基础及新途径。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 体外细胞分子生物学及体内动物实验。 1.2 时间及地点 实验于2016年2月至2017年12月在华中科技大学同济医学院附属协和医院中心实验室和华中科技大学同济医学院附属协和医院眼科实验室完成。 1.3 材料
1.3.1 实验动物 健康SPF级雄性SD大鼠50只(用于细胞培养30只，用于体内实验20只)，七八周龄，体质量180- 220 g，购于华中科技大学同济医学院实验动物中心。经裂隙灯筛查确认角膜透明无活动性炎症。动物实验过程中的设计、方法和实施符合美国视觉与眼科研究协会(ARVO)声明以及华中科技大学同济医学院附属协和医院伦理委员会的批准(批准号：[2014]伦审字037号)，实验动物均在麻醉下进行所有手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
HAN B, YANG Z, LI J, ZHANG MC. Regulation of limbal stem cells via Wnt signaling in the treatment of limbal stem cell deficiency.
Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2020;24(7):1057-1062. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2028
1.3.2 实验试剂及仪器 DMEM/F12培养基、Knockout血清代替物、DMEM高糖培养基、胰蛋白酶/EDTA(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)；MatrigelTM Basement Membrane Matrix(美国BD公司)；中性蛋白酶Ⅱ(美国Roche公司)；氯化锂(美国Sigma-Aldrich公司)； Anti-beta Catenin抗体(美国Abcam公司)；显微镜(日本奥林巴斯公司)；细胞培养板、培养皿、培养瓶(美国Corning公司)；实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。 1.4 实验方法
1.4.1 细胞分离及培养 取SD大鼠角膜缘组织置于含有Dispase Ⅱ(10 g/L)的改良胚胎干细胞培养基(MESCM)中放入培养箱30 min，在显微镜下机械分离获得完整的角膜缘上皮细胞片。将角膜缘上皮细胞片置于0.25%胰蛋白酶/ 1 mmol/L EDTA中放入培养箱15 min，中止消化得到单个角膜缘干细胞。将单个角膜缘干细胞以1.2×105/cm2密度接种于提前孵育好的3D-Matrigel培养体系中，实验组培养体系中加入Wnt信号通路激活剂氯化锂(500 μmol/L)，对照组不加氯化锂，每隔2 d换液1次。培养第7天，收集角膜缘干细胞备用。
1.4.2 实时定量PCR检测p63α、CK12、Ki-67和CEBPδ基因表达 采用实时定量PCR检测实验组和对照组干性指标p63α、CK12，增殖水平指标Ki-67以及细胞功能指标CEBPδ的表达。提取各样本RNA，反转录成cDNA，-20 ℃保存，引物信息见表1。循环条件为95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火并延伸30 s，共40个循环，按2-
ΔΔCt 法计算各目的基因的相对表达量。
表1
各基因引物序列
Table 1 Primer sequences of genes
名称 引物 序列
大小 GAPDH
Reverse 5'-TTG CTG ACA ATC TTG AGG GAG-3' 176 bp Forward 5'-GGT GCT GAG TAT GTC GTG GAG-3' CK12
Reverse 5'-TTT GGA GAC CGT GAG GGA TAA-3' 234 bp Forward 5'-GAA ACC GAG GGT GGA TAC TGC-3' CEBPδ Reverse 5'-TTG AAG AGG TCG GCG AAG AT-3' 247 bp Forward 5'-TTT TCA GCC TAG ACA GCC CA-3' p63α
Reverse 5'-CTG AAG TAG GTG TTG GTG CTG-3' 125 bp Forward 5'-GCC GTG AGA CTT ATG AAA TGC-3'
Ki-67
Reverse 5'-TGT CAC GGC AGA GAG TTC TT-3' 173 bp
Forward
5'-CGG AGC ACT TTG AAA CAC CA -3'
1.4.3 免疫荧光染色检测Wnt信号通路 将收集的细胞悬液利用细胞甩片机制作成细胞甩片，40 g/L多聚甲醛固定15 min后使用山羊血清封闭，随后加入Anti-β-Catenin抗体，放入湿盒4 ℃孵育过夜，第2天加入荧光二抗，放入湿盒37 ℃避光1 h，复染核后封固，荧光显微镜下观察并采集图像。
1.4.4 克隆形成实验 首先制备3T3滋养细胞层，在3T3-J2细胞中加入4 mg/L丝裂霉素C，37 ℃处理2 h，按2×104/cm2密度接种于6孔板中，加入DMEM培养基培养
24 h后备用。收集培养第7天的角膜缘干细胞接种于预先准备的已接种3T3滋养层细胞的6孔板中，每孔接种1 000个角膜缘干细胞，每5 d换液1次，2周后使用罗丹明B染色后，在显微镜下计数克隆数量，克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%。
1.4.5 角膜缘干细胞缺乏症动物模型的建立及治疗 20只SD大鼠麻醉起效后，将浸有1 mol/L NaOH溶液的无菌滤纸环(外径8 mm，内径4 mm)覆盖于双眼角膜缘30 s，取下滤纸，生理盐水反复冲洗2 min，刮除角膜中央及角膜缘处的上皮。术后每天给予可乐必妥滴眼液滴眼(4次/d)，隔日使用裂隙灯观察眼表情况。术后2周对角膜缘干细胞缺乏动物模型进行评分，同时满足角膜荧光染色评分≥2分、角膜混浊度≥2分以及角膜新生血管≥3分者纳入后续实验[14]，见表2。将满足条件的大鼠分为2组，其中治疗组结膜下注射激活Wnt信号通路后的异体角膜缘干细胞(3×105/200 μL)，对照组注射等量PBS。治疗后隔日观察大鼠眼表情况。
表 2 角膜缘干细胞缺乏模型评分标准
Table 2 Scoring criteria for limbal stem cell deficiency model
指标
0分 1分 2分 3分 4分 角膜荧光
阴性 阳性 阳性
阳性
阳性
染色
≤1/4象限 ≤1/2象限 ≤3/4象限 >3/4象限
角膜混浊角膜透虹膜纹理可见 虹膜纹理不隐约可见瞳瞳孔不可度
明 清 孔 见 角膜新生
无新生角膜缘内2 mm周边可见
周边可见
全角膜可血管
血管
可见
≤1/2象限 >1/2象限
见
1.4.6 苏木精-伊红染色观察角膜缘干细胞缺乏模型大鼠角膜上皮形态 细胞治疗后第4天处死大鼠，分别获取治疗
组和对照组大鼠角膜缘组织，用40 g/L多聚甲醛在4 ℃条件下固定24 h，脱水进行石蜡包埋；切片机制作4 μm切片，烤片及脱蜡，加入苏木精染色5 min，1%的盐酸乙醇分化 4 s，加入1%水溶性伊红2 min，无水乙醇脱水，风干封固，倒置显微镜下观察并采集图像。
1.4.7 石蜡切片免疫荧光染色检测角膜组织中Wnt信号通路状态 取上述石蜡切片进行烤片及脱蜡后进行抗原修复，随后加入Anti-β-Catenin抗体，放入湿盒4 ℃孵育过夜，第2天加入荧光二抗，放入湿盒37 ℃避光1 h，复染核后封固，荧光显微镜下观察并采集图像。
1.5 主要观察指标 ①大鼠角膜缘干细胞在3D-Matrigel培养体系中的形态以及β-catenin的表达；②Wnt信号通路激活对于角膜缘干细胞干性及增殖能力的影响；③结膜下注射角膜缘干细胞后，大鼠角膜恢复情况以及形态学变化；④结膜下注射角膜缘干细胞后，大鼠角膜组织中β-catenin的表达。
1.6 统计学分析 使用SPSS 20.0统计软件处理，数据以x_
±s表示，比较组间差异采用独立样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。
1059
韩波，杨喆，栗静，张明昌. Wnt信号通路调控角膜缘干细胞治疗角膜缘干细胞缺乏症[J]. 中国组织工程研究，2020，24(7):1057-1062. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2028
2 结果 Results
2.1 大鼠角膜缘干细胞在3D-Matrigel培养体系中的形态以及角膜缘干细胞中β-catenin的表达 对照组角膜缘干细胞在3D-Matrigel微环境中聚集成细胞球生长，实验组角膜缘干细胞在3D-Matrigel微环境中依旧呈球形生长，见图1A。用免疫荧光实验方法检测β-catenin在细胞中的表达，对照组角膜缘干细胞中未见β-catenin在胞浆或者细胞核内聚集，实验组可见β-catenin在角膜缘干细胞的细胞浆和细胞核内聚集，见图1B。
2.2 Wnt信号通路激活对于角膜缘干细胞干性及增殖能力的影响 实验组和对照组角膜缘干细胞中反映细胞干性的指标(P63α，CK12)以及反映细胞功能的指标(CEBPδ)差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图2A；实验组角膜缘干细胞中Ki-67表达明显升高，与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2B；克隆形成实验的数据显示，实验组总克隆形成率较对照组明显增高，差异有显著性意义(P < 0.05)，其中实验组全克隆形成率较对照组多，实验组旁克隆形成率较对照组少，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图2C。
2.3 治疗组与对照组角膜缘干细胞缺乏症大鼠角膜修复情况以及形态学变化 裂隙灯观察发现对照组大鼠角膜组织水肿明显，而治疗组大鼠角膜组织在治疗后第2天达到水肿高峰后逐渐减轻；在治疗第4天，治疗组与对照组相比角膜混浊程度明显减轻，同时上皮修复较对照组明显好转。荧光染色后显示治疗组角膜上皮染色阴性，上皮完整修复较好，而对照组大鼠角膜荧光染色阳性，见图3A；在细胞治疗后第4天临床混浊评级结果显示：治疗组大鼠较对照组大鼠角膜混浊评分明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05) (n= 12)，见图3B。治疗第4天处死大鼠，取角膜组织行苏木精-伊红染色，对照组角膜上皮细胞形态大小不一，排列紊乱，同时可见杯状细胞增生；而治疗组大鼠角膜上皮细胞形态一致，大小较均一，排列整齐，未见杯状细胞增生，见图3C。 2.4 治疗组与对照组角膜缘干细胞缺乏症大鼠角膜组织中β-catenin的表达 为了进一步证明Wnt信号通路在角膜修复过程中的作用，在治疗第4天处死大鼠后，使用免疫荧光染色检测β-catenin在角膜组织中的表达，发现治疗组大部分角膜上皮细胞中β-catenin在细胞浆以及细胞核内聚集，而对照组角膜上皮细胞中β-catenin仅是弱阳性，未见在胞浆聚集或者进核，见图4。
3 讨论 Discussion
角膜缘干细胞是角膜上皮细胞自我更新以及角膜损伤修复的细胞基础。与其他成体干细胞相同，部分角膜缘干细胞进入自我更新状态，维持其干细胞特性，保持干细胞池的稳定，另一部分角膜缘干细胞则转化成为短暂扩充细胞[15]，最终增殖和终末分化成为角膜上皮细胞，完成角膜上皮细胞的更新修复。成体干细胞通常都是以静止和激活2
1060
种状态同时存在于体内[2
，16]
，从而维持干细胞的动态平衡。
临床上角膜缘干细胞缺乏症患者，角膜组织由于缺乏干细胞，导致角膜透明性无法维持，明显影响患者视力及生活质量，使得治疗角膜缘干细胞缺乏症成为急需解决的临床难题。体外培养具有特殊功能的角膜缘干细胞有望为解决角膜缘干细胞缺乏症这一难题提供新手段[17]。
Matrigel是由层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白等成分构成的一种基质胶，可用来模拟体内细胞的基底膜，而基底膜是多种干细胞生存所需的重要微环境。因此该研究使用3D-Matrigel体外培养体系模拟角膜缘上皮干细胞生长微环境。
既往研究表明，当干细胞相互聚集成球样生长时，通过细胞间紧密接触能有效减少干细胞自身分化，使干细胞的干性得以维持[18]。研究结果显示：在3D-Matrigel体外培养体系中，角膜缘干细胞聚集成球形生长，实验组和对照组之间细胞球形态大小以及松散程度均无明显差异。由此作者推测3D-Matrigel培养体系有利于角膜缘干细胞干性的维持，是一种理想的角膜缘干细胞培养体系。
Wnt信号通路在维持多种干细胞特性中起重要作用，与此同时还参与调控干细胞分化[19]。对于角膜缘干细胞，Wnt信号通路是否亦能对其细胞特性及分化产生重要的调控作用呢？作者通过在实验组培养体系中加入氯化锂(Wnt信号通路激活剂)[20]，激活角膜缘干细胞中Wnt信号通路，观察Wnt信号通路对角膜缘干细胞特性及分化的影响，结果显示：实验组角膜缘干细胞中β-catenin在细胞浆和细胞核内聚集，表明实验组角膜缘干细胞的Wnt信号通路被激活，而对照组角膜缘干细胞中Wnt信号通路处于未激活状态。Wnt信号通路激活后角膜缘干细胞的干性及功能发生了哪些变化呢？qRT-PCR实验结果显示：角膜缘干细胞干性标志物p63α[21]、分化标志物CK12[22]、细胞功能指标CEBPδ[23]，三者在实验组和对照组之间差异均无显著性意义(P > 0.05)，说明当Wnt信号通路激活后，角膜缘干细胞干性得到维持。通过对反映细胞增殖能力的指标Ki-67进行检测[24]，发现实验组角膜缘干细胞的Ki-67水平明显升高 (P < 0.05)，说明Wnt信号通路激活后角膜缘干细胞的增殖能力明显增强。干性得到维持同时增殖能力增强是否说明Wnt信号通路的激活使得角膜缘干细胞进入到自我更新状态呢？于是进一步行克隆形成实验，克隆形成实验是检测干细胞功能常用的实验方法，结果显示：总克隆形成率实验组较对照组明显增高，差异有显著性意义(P < 0.05)，其中实验组全克隆形成率较对照组多，实验组旁克隆形成率较对照组少，差异均有显著性意义(P < 0.05)。众所周知，全克隆是由年轻的干细胞形成，而旁克隆多由暂时放大细胞(TAC)形成，此处实验组产生较多的全克隆，较少的旁克隆，说明实验组角膜缘干细胞相对于对照组属于较年轻的干细胞，同时具有相对较强的增殖能力，这种状态类似于干细胞的自我更新。
HAN B, YANG Z, LI J, ZHANG MC. Regulation of limbal stem cells via Wnt signaling in the treatment of limbal stem cell deficiency.
Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2020;24(7):1057-1062. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2028
综合以上数据，Wnt信号通路对角膜缘干细胞干性并没有表现出明显的调控作用，但是Wnt信号通路的激活明显增强了角膜缘干细胞的增殖能力。因此作者推测Wnt信号通路的激活促使角膜缘干细胞处于一个并未分化的高增殖能力状态，类似干细胞的自我更新状态。作者猜想Wnt信号通路激活的角膜缘干细胞可能是治疗角膜缘干细胞缺乏症的理想细胞，为临床角膜缘干细胞缺乏症的治疗提供了新的思路。
为了进一步验证作者的猜想，首先建立大鼠角膜缘干细胞缺乏症模型(化学烧伤法
[25-26]
)，然后以激活了Wnt信号
通路的角膜缘干细胞为治疗材料，以结膜下注射的方式对角膜缘干细胞缺乏症大鼠进行治疗。实验结果显示经过细胞治疗后大鼠角膜上皮修复良好，角膜混浊程度评分较对照组明显降低。治疗组大鼠角膜组织中发现β-catenin在上皮细胞的胞浆和细胞核中聚集，说明起到修复作用的正是Wnt信号通路激活了的角膜缘干细胞，再次验证Wnt信号通路激活后的角膜缘干细胞在角膜缘干细胞缺乏症大鼠角膜上皮修复过程中起到了关键性的作用。
虽然Wnt信号通路调控和影响细胞生长和分化的机制尚未明确，但是该信号通路对干细胞的调控起到非常重要的作用已取得广泛共识[27-28]。因此对于Wnt信号通路如何促进角膜缘干细胞增殖同时保持细胞干性的具体机制，值得进一步深入研究。
作者贡献：实验设计为韩波，实验实施为韩波、杨喆、栗静，实验评估为
韩波、张明昌，资料收集为杨喆。
经费支持：该文章接受了“国家自然科学基金(81400378)”的资助。所有
作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利
益冲突。
机构伦理问题：实验方案经华中科技大学同济医学院附属协和医院伦理委
员会的批准，批准号为[2014]伦审字037号。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和
医学期刊编辑与发表的推荐规范》。
文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3次查重。 文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊
发稿宗旨。
生物统计学声明：文章统计学方法已经通过华中科技大学同济医学院附属
协和医院生物统计学专家审核。
文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。 开放获取声明：这是一篇开放获取文章，根据《知识共享许可协议》“署名-非商业性使用-相同方式共享4.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。
4 参考文献 References
[1] BREHM JL, LUDWIG TE. Culture, Adaptation, and Expansion of Pluripotent Stem Cells. Methods Mol Biol. 2017;1590:139-150. [2] LI L, CLEVERS H. Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals. Science. 2010;327(5965):542-545.
[3]
SUN TT, TSENG SC, LAVKER RM. Location of corneal epithelial stem cells. Nature. 2010;463(7284):E10-11.
[4] SAGHIZADEH M, KRAMEROV AA, SVENDSEN CN, et al. Concise Review: Stem Cells for Corneal Wound Healing. Stem Cells. 2017; 35(10):2105-2114.
[5] ROSSEN J, AMRAM A, MILANI B, et al. Contact Lens-induced Limbal Stem Cell Deficiency. Ocul Surf. 2016;14(4):419-434.
[6] ESPANA EM, GRUETERICH M, ROMANO AC, et al. Idiopathic limbal stem cell deficiency. Ophthalmology. 2002;109(11):2004-2010. [7]
SEHIC A, UTHEIM ?A, OMMUNDSEN K, et al. Pre-Clinical
Cell-Based Therapy for Limbal Stem Cell Deficiency. J Funct Biomater. 2015;6(3):863-888.
[8] LI G, ZHANG Y, CAI S, et al. Human limbal niche cells are a powerful regenerative source for the prevention of limbal stem cell deficiency in a rabbit model. Sci Rep. 2018;8(1):6566.
[9] SATAKE Y, HIGA K, TSUBOTA K, et al. Long-term outcome of cultivated oral mucosal epithelial sheet transplantation in treatment of total limbal stem cell deficiency. Ophthalmology. 2011;118(8):1524-1530.
[10] 王舒,张红.干细胞治疗角膜损伤的研究进展[J].眼科新进展, 2018,38(12): 1191-1195.
[11] RAO TP, KüHL M. An updated overview on Wnt signaling pathways: a prelude for more. Circ Res. 2010;106(12):1798-1806.
[12] 毛杰,周翊飞,吴晓玲,等.雌激素介导下Wnt/β-catenin 信号通路调控人牙周膜干细胞的成骨分化[J].中国组织工程研究, 2018,22(13):2087-2092. [13]
李巍,户小伟,冼呈,等.骨髓间充质干细胞移植联合氯化锂治疗兔股骨头缺血坏死疗效[J].中国组织工程研究, 2016,20(6):868-875.
[14] 杨威,顾国贞,宋鄂,等.羊膜为载体的人角膜缘上皮细胞移植治疗大鼠角膜碱烧伤的研究[J].中华眼科杂志,2007,43(2):134-141.
[15] MORRISON SJ, KIMBLE J. Asymmetric and symmetric stem-cell divisions in development and cancer. Nature. 2006;441(7097): 1068-1074.
[16] WANG YZ, PLANE JM, JIANG P, et al. Concise review: Quiescent and active states of endogenous adult neural stem cells: identification and characterization. Stem Cells. 2011;29(6):907-912.
[17] 刘祖国,王国良,李程.努力开创角膜缘干细胞临床研究新局面[J].中华实验眼科杂志,2018,36(11):822-825.
[18] LI GG, ZHU YT, XIE HT, et al. Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2012;53(9): 5686-5697.
[19]
LI S, LU X, HE H, et al. A novel culture system robustly maintained pluripotency of embryonic stem cells and accelerated somatic reprogramming by activating Wnt signaling. Am J Transl Res. 2017; 9(10):4534-4544.
[20] SPENCER GJ, UTTING JC, ETHERIDGE SL, et al. Wnt signalling in osteoblasts regulates expression of the receptor activator of NFkappaB ligand and inhibits osteoclastogenesis in vitro. J Cell Sci. 2006;119(Pt 7):1283-1296.
[21] PELLEGRINI G, DELLAMBRA E, GOLISANO O, et al. p63 identifies keratinocyte stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98(6): 3156-3161.
[22]
LIU CY, ZHU G, CONVERSE R, et al. Characterization and
chromosomal localization of the cornea-specific murine keratin gene Krt1.12.J Biol Chem. 1994;269(40):24627-24636.
[23]
BARBARO V, TESTA A, DI IORIO E, et al. C/EBPdelta regulates cell cycle and self-renewal of human limbal stem cells. J Cell Biol. 2007; 177(6):1037-1049.
[24]
WINKING H, GERDES J, TRAUT W. Expression of the proliferation marker Ki-67 during early mouse development. Cytogenet Genome Res. 2004;105(2-4):251-256.
[25] ARIKAN S, KARACA T, ERTEKIN YH, et al. Effect of Topically Applied Azithromycin on Corneal Epithelial and Endothelial Apoptosis in a Rat Model of Corneal Alkali Burn. Cornea. 2016;35(4):543-549.
[26] BAI JQ, QIN HF, ZHAO SH. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. Int J Ophthalmol. 2016;9(4):487-490.
[27] 林治平,曾荣,林颢.基因芯片技术分析骨髓间充质干细胞神经分化中Wnt信号通路的激活[J].中国组织工程研究, 2016,20(10):1389-1395. [28]
BRAFMAN D, WILLERT K. Wnt/β-catenin signaling during early vertebrate neural development. Dev Neurobiol. 2017;77(11): 1239-1259.
1061
韩波，杨喆，栗静，张明昌. Wnt信号通路调控角膜缘干细胞治疗角膜缘干细胞缺乏症[J]. 中国组织工程研究，2020，24(7):1057-1062. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2028
A B nucleus
对照组 实验组
对照组 治疗组
nucleus
对照组 实验组
β-catenin
β-catenin/ nucleus
β-catenin
β-catenin/
nucleus
图注：图中A显示实验组和对照组大鼠角膜缘干细胞在3D-Matrigel 微环境中均聚集成细胞球生长；B显示对照组角膜缘干细胞中未见 β-catenin在胞浆或者细胞核内聚集，而实验组角膜缘干细胞中可见β-catenin 在角膜缘干细胞的细胞浆和细胞核内聚集
图1 大鼠角膜缘干细胞在3D-Matrigel培养体系中的形态以及角膜
缘干细胞中β-catenin的表达
Morphology of rat limbal stem cells in 3D-Matrigel culture Figure 1
system and expression of β-catenin in limbal stem cells
图注：治疗组大部分角膜上皮细胞中β-catenin在细胞浆以及细胞核
内聚集，而对照组角膜上皮细胞中β-catenin仅是弱阳性，未见在胞浆聚集或者进核
图4 治疗组与对照组角膜缘干细胞缺乏症大鼠角膜组织中β-catenin的表达
Figure 4 Expression of β-catenin in corneal tissue of rats with limbal stem cell deficiency in the treatment and control groups
A mRNA相对表达 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
克隆形成率(%) 1.2 1.0 0.8 Ki-67 mRNA相对表达 1.4 对照组 实验组 B
1.4 0.6 0.4 0.2 0
CK12 P63α CEBPδ
C 8 7 6 5 4 3 2 1 0 对照组 实验组
a a a 对照组 实验组 a 总的克隆 全克隆 部分克隆 旁克隆
图注：图中A表示两组角膜缘干细胞中干性指标P63α，CK12以及功能指标CEBPδ表达水平的差异；B表示两组角膜缘干细胞中Ki-67表达
aa
水平的差异，与对照组比较，P < 0.05；C表示两组细胞克隆形成效率的差异，与对照组比较，P < 0.05
图2 Wnt信号通路激活对于角膜缘干细胞干性及增殖能力的影响
Effect of Wnt signaling activation on the function and proliferation of limbal stem cells Figure 2
A
对照组 治疗组
B
4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0
C 临床混浊分级 a 对照组 治疗组
图注：以及荧光染色后观察角膜上皮修复情况；B为治疗后第4天两组大鼠角膜组织临床混浊评级结果， 图中A为裂隙灯下观察角膜水肿情况，
a
与对照组比较，P < 0.05；C为治疗第4天两组大鼠角膜组织苏木精-伊红染色结果
图3 治疗组与对照组角膜缘干细胞缺乏症大鼠角膜修复情况以及形态学变化
Corneal healing and morphological changes in rats with limbal stem cell deficiency of treatment and control groups Figure 3
1062
Wnt信号通路调控角膜缘干细胞治疗角膜缘干细胞缺乏症 - 图文
