欧阳科创编 2021.02.05
Western Blot基本原理、
过程及注意事项
时间：2021.02.05 创作：欧阳科 原理
是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 主要有三个过程：蛋白质电泳、转膜、检测。 样品的准备
样品种类主要有培养的细胞、组织（需磨碎）、特殊细胞（切割下来的肿瘤细胞）等。
1、
裂解液主要有RIPA和三去污两种，RIPA适用于
细胞质中蛋白检测，而三去污适用于总蛋白。三去污又分为离子型和非离子型。离子型的裂解能力较强如SDS等，非离子型的包括NP-40、Tritonx-100。
2、
裂解液的成分，
试剂 Nacl Tris-盐酸缓冲液 SDS 水 PMSF、Cocktail等 作用 增加离子强度 pH 裂解剂 溶剂 蛋白酶抑制剂 欧阳科创编 2021.02.05
欧阳科创编 2021.02.05 磷酸酶抑制剂 Cocktail等 3、
样品缓冲液 sample buffer
试剂 SDS Tris缓冲液 DTT 甘油 溴酚蓝 作用 增加负电 pH 抗氧化 密度 指示剂 备注：
1、样品应保持低温，且实验过程应低温操作，此举为了抑制酶的活性。裂解完后样品液会显得粘稠是长结构DNA所致，故需要匀浆，打断DNA。一般不用超声，因为容易引起蛋白不可逆的变性。
2、用2X样品缓冲液与样品1：1混匀。4度保存。 3、样品混合液加样前需要100℃或沸水浴加热3-5分钟并迅速插入冰中，以充分变性蛋白。
配胶：
胶的主要成分为丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。
4、
H2O 30﹪Acrylamide 分离胶的配方：以20ml的8﹪分离胶为例：
9.3 ml 5.3 ml 欧阳科创编 2021.02.05 欧阳科创编 2021.02.05 1.5M Tris（PH8.8） 5.0 ml 10XSDS 10X过硫酸胺(AP) TEMED 5、 H2O 30﹪Acrylamide 1M Tris(PH6.8) 10X SDS 10X 过硫酸胺(AP) TEMED 0.2 ml 0.2 ml 0.012ml 浓缩胶配方：6ml为例
4.1 ml 1.0 ml 0.75 ml 0.06 ml 0.06 ml 0.006 ml 备注：
1、制胶是避免产生气泡，空气会影响胶的聚合，在蛋白质表观分子量分析时影响大。
2、因为有SDS，每次混匀时 不应剧烈以免产生过多气泡。
3、蛋白容易与SDS脱离而失去负电荷,因此胶中加入SDS为了给蛋白持续的负电荷。
4、垫条清洗干净，与制胶板压紧，避免漏胶。 5、制胶时，加水应缓慢不要破坏胶面，其作用：可以平衡胶面，赶气泡等。胶固定后用滤纸吸除干净，有水跑胶时条带会歪。
6、先插梳子再灌浓缩胶。溴酚蓝快跑出胶时停止。
转膜
根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因
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Western Blot基本原理、过程及注意事项之欧阳科创编
