* 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长,保证序列独特性,并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交,降低了特异性,而且比短序列杂交慢,从而降低了产量。
* 选择GC含量为40%到60%或GC含量反映模板GC含量的引物。
* 设计5'端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。
* 避免引物对3'末端存在互补序列,这会形成引物二聚体,抑制扩增。
* 避免3'末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。 * 避免3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。 * 避免存在可能会产生内部二级结构的序列,这会破坏引物退火稳定性。 目的序列上并不存在的附加序列,如限制位点和启动子序列,可以加入到引物 5'端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列,但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。
有时候,仅有有限的序列信箱可供用于引物设计。比如,如果仅知道氨基酸序列,可以设计简并引物。简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性,可以参考密码子使用表,根据不同生物的碱基使用偏好,减少简并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对,降低引物的退火温度。不要在引物的3'端使用简并碱基,因为3'端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引物浓度(1μM到3μM,因为许多简并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。
【经验】如何确认RNA的质量
各位都知道， 提取到质量良好的 RNA （包括总 RNA 和 mRNA， 以下同） 是非常困难， 关于 RNA 的提取技术，我就不说了，为什么呢？或许各位非常关心呢，我是这样 想的，我可以看到的资料或者是厂家的说明书，各位也同样可以看到的，内容当 然都是一样的了，所以实验做的好不好，主要是心的投入多少的问题，所以希望 大家自己多多思考啊！ 以下两种方法，相信大家都知道的： 1）检测 RNA 溶液的吸光度 280、320、230、260nm 下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐 浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看 OD260/OD280（Ratio，R）。 1.82.0 时，我们认为 RNA 中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过 要注意，当你用 Tris 作为缓冲液检测吸光度时，R 值可能会大于 2（一般应该是 <2.2 的）。当 R<1.8 时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可 以根据自己的需要决定这份 RNA 的命运。当 R>2.2 时，说明 RNA 已经水解成单核 酸了。 如果 RNA 的量够，可在 260nm（A260）用分光光度法测定 RNA 的得率，1 个单位 等于 40ug/mlssRNA。纯 RNA 的 A260/A280 的比值为 2.0。A260/A230 的比值还表 明 RNA 的纯度，其值小于 2.0 表明裂解液中有亚硫氰胍和 belta-巰基乙醇残留， 其值大于 2.4，需用乙酸盐，乙醇沉淀 RNA。 2）RNA 的电泳图谱 一般的，RNA 的电泳都是用变性胶进行的，但是根据我的经验，如果你仅仅是为 了检测 RNA 的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的， 用普通的琼脂糖胶就可以 了。 电泳的目的是在于检测 28S 和 18S 条带的完整性和他们的比值，或者是 mRNA smear 的完整性。一般的，如果 28S 和 18S 条带明亮、清晰、条带锐利（指条带 的边缘清晰），并且 28S 的亮度在 18S 条带的两倍以上，我们认为 RNA 的质量是 好的（见下图）。 以上是我们常用的两种方法， 但是这两种方法都无法明确的告诉我们 RNA 溶液中 有没有残留的 RNA 酶。如果溶液中有非常微量的 RNA 酶，用以上方法我们很难察 觉，但是大部分后续的酶学反应都是在 37 度以上并且是长时间进行的。这样， 如果 RNA 溶液中有非常微量的 RNA 酶， 那么在后续的实验中就会有非常适合的环 境和时间发挥它们的作用了，当然这时你的实验也就完了。 下面，我们介绍一个可以确认 RNA 溶液中有没有残留的 RNA 酶的方法。 3）保温试验 方法很简单的，按照样品浓度，从 RNA 溶液中吸取两份 1000 ng 的 RNA 加入至 0.5 ml 的离心管中,并且用 pH7.0 的 Tris 缓冲液补充到
10 ul 的总体积，然后 密闭管盖。把其中一份放入 70℃的恒温水浴中,保温 1 h。另一份放置在-20℃冰 箱中保存 1 h。 时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如 果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法 2 中的条 件），则说明 RNA 溶液中没有残留的 RNA 酶污染，RNA 的质量很好。相反的，如 果 70℃保温的样本有明显的降解，则说明 RNA 溶液中有 RNA 酶污染。 如果你的 RNA 样本通过了保温实验的检测并且你在后续的实验中还是非常小心 的防范 RNA 酶的骚扰，那么你的实验应该是很难失败了！
RT-PCR实验方法总结大全.
