病毒学实验技术

病毒学实验技术

病毒学实验技术

实验一 鸡胚接种

器材：鸡胚 打孔器 注射器 针头 照蛋灯 蛋座 病毒液 石蜡 碘酊棉球 酒精棉球鸡胚孵化→病毒接种（NDV、EDS—76、IBV→效价测定（HA、HI） 一．精卵的选择、孵育和检卵

1. 受精卵的选择

1） 最好来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响 2） 最好是白克蛋

3） 受精卵必须新鲜，保存在5—20℃不要超过10天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。

2. 孵育

1） 孵箱温度保持37.5—38.5℃ 2） 相对湿度：50-60%

3） 保证新鲜空气流通，尤孵化5-6天后 4） 孵育后第三天开始，每天翻卵一次 3. 检卵

孵育后第4天开始，每天检卵一次。4日卵可见血管。未受精卵不见血管鸡胚。死胚血管模糊，无胎动。 二．鸡胚的结构

1．卵壳 上有细孔，以行气体交换

2．壳膜 行气体和液体分子交换，故须一定湿度和气流 3．气室 呼吸和调节压力

4．绒毛尿囊腔 胚胎呼吸器官，膜血管—O2—卵壳孔交换

5．尿囊腔 胚胎排泄器官，尿囊液初为通明，12-13天后因尿酸盐增多而渐浑浊。 6．羊膜腔 胚胎浸泡于其中羊水 7．卵黄 早期养分 8．卵白 晚期养分 三．接种前处理

1．做接种记号 2．消毒 四．接种途径

卵黄囊、尿囊腔、绒毛尿囊膜、羊膜腔、静脉、胚体

1．卵黄囊接种法 虫媒披膜病毒、衣原体、立克氏体等分离和增殖 方法一：1）6-8日龄胚，画出气室和胚位，大头朝下 2）碘及酒精消毒气室端

3）钢锥在气室中央锥一小孔

4）注射器吸取病毒液，沿小孔垂直刺入3cm，0.1-0.3ml/胚 5）熔蜡封孔，续孵，弃24H内死胚 方法二：1）2）同一

3）卵横放，胚朝下，卵长1/2处消毒

4）钢锥锥一小孔，注射器吸取病毒液，沿小孔垂直刺入1.5CM，0.1-0.5ml/胚 5）封孔，续孵，弃24h内死胚

2．绒毛尿囊膜接种法 痘病毒和疱疹病毒分离和增殖 方法一：1）10-12日龄胚，画气室，消毒

2）在气室端开 一1.5×1.5口 3）灭菌镊子撕去一小片内壳膜 4）滴入接种物

5）胶布或透明纸封口 方法二：（人工气室）

1） 在胚胎附近近气室处，选血管少处，烙一直径3-4mm的烤焦圈] 2） 消毒，刀撬起卵壳造成卵窗 3） 在气室端中央钻一个小孔

4） 用针尖挑破卵窗中心的壳膜，勿损伤其下的绒毛尿囊膜，滴加生理盐水于刺破出 5） 橡皮乳头于小孔上吸气，形成人工气室，可见绒毛尿囊膜上滴加的生理盐水下渗 6） 用1mlL注射器滴2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上 7） 胶布或透明纸封口，熔蜡封孔

8） 鸡胚横卧孵育，勿翻动，卵窗向上

3．尿囊腔接种法 用于正粘病毒，副粘病毒分离和增殖

1） 选10-12日龄胚，画气室胚位，消毒 2） 钢锥锥一小孔

3） 注射器吸取病毒液，沿小孔刺入0.5-1cm，0.1-0.2/胚 4） 熔蜡封孔，续孵，检卵1次/天，弃24h内死胚 静脉接种：蓝舌病毒；脑内接种：狂犬病毒

实验二 原代细胞培养（鸡胚成纤维细胞）

器材：鸡胚 碘酊棉球，酒精棉球 照蛋灯 蛋座 大剪子 眼科剪 镊子 平皿 培养基 胰酶 水浴锅 大青霉素瓶 吸管 吸球 细胞瓶 瓶塞

一．实验目的：了解原代细胞培养的一般方法和用途 二．实验步骤：

1. 取9-12日龄鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒 2. 无菌夹起鸡胚置于无菌平皿

3. 眼科剪镊去头、四肢及内脏，Hank’S洗液两次 4. 剪碎近于乳糜状

5. 将剪碎组织倒入锥形瓶或烧杯或大青霉素瓶，Hank’S两次，然后加入4倍量的（5ml）0.25%胰酶，调PH值7.6-7.8（NaHCO3 5.6%、7.5%、8.8%），混匀后置37℃水浴20-30分钟，期间每10min摇动一次，使细胞消化完全（组织块变松散，沉降变缓慢时表示消化足够）

6. 消化好后，取出瓶子，静置几分钟，洗去胰酶液，加含有犊牛血清的Hank’S液生长液约10ml，轻摇后吸去，重复一次，目的洗去残留的胰酶和抑制其消化作用

7. 加入生长液10ml，以粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落分散，静置1-2分钟，使组织块下降，轻吸出细胞悬液于离心管中

8. 平衡后以2000r/min10min，弃上清，用10ml Hank’S液生长悬浮沉淀，分装于两个细胞瓶中，2ML/瓶。使细胞量约为50万个/ml，再补加Hank’S生长液至10ml，37℃培养

实验三 传代细胞培养

（传代细胞=遗传突变/理化学物质作用/致瘤病毒作用=异倍体癌变细胞；多来自动物或