体外生物测定及其在新药开发中的应用(精)

体外生物测定及其在新药开发中的应用

沈嘉

摘 要：简介用体外模型以离体细胞或纯化酶测定试验样品，对受体及酶的拮抗或抑制作用的体外生物测定法在国外新药及标准提取物和日本汉方制剂研究开发过程中的应用。 关键词：受体；酶；标准提取物；日本汉方药；拮抗剂；抑制剂

IN VITRO BIOASSAY AND ITS APPLICATIONS IN NEW DRUG DEVELOPMENT

Shen Jia

(Department of Traditional Chinese Medicines,Shenyang

Pharmaceutical University, Shenyang 110015)

ABSTRACT：The applications of in vitro bioassay which util izes in vitro model,isolated cells or purified enzyme to measure the antagonisti c or inhibitive effects on receptor or enzyme,in development of new drug,standard ext ract and Japanese-Chinese traditional herbal medicine were briefly introduced.

KEY WORDS：Receptor; Enzyme; Standardized extract; Japanese-C hinese traditional herbal medicine; Antagonist; Inhibitor▲

无论以传统方法还是以最新的组合化学技术开发药用活性成分都需要筛选大量的化合物，这需要高效、快速、准确的生物学活性测定方法作为筛选手段，而体外生物测定法正是适用于较大规模的各种成分的活性筛选方法之一。体外生物活性研究有多种形式如：细胞培养、模拟体内条件以离体细胞或纯化酶测定试验样品对受体及酶的拮抗或抑制作用等等。现在着重从以下4个方面简介后一种形式及其在新药开发中的应用。

1 在传统植物药研究开发中体外生物测定的应用

对从北美金缕梅、锐刺山楂及欧洲七叶树中分得的8个化合物外加一个合成化合物进行体

外活性研究，以大鼠嗜碱细胞性白血病的细胞溶质组分（5-LO主要来源）及绵羊肠淋巴结制品（AT主要来源）测定活性。结果表明，化合物中有4个5-LO抑制剂及5个AT抑制剂，其中一个化合物具有双重抑制活性。这一研究既找到了上述植物药抗炎活性的物质基础，有利于进一步开发其药用价值，也为开发新合成药做了工作［1］。在大鼠肝微粒体中加硫酸亚铁做脂质过氧化的起始剂，以测定加入的硫巴比妥酸的反应物来评价脂质过氧化百分率，用这一体外试验测得柱状田头菇中分离出的2个化合物可有效地抑制脂质过氧化反应，并具有消除自由基的活性［2］。1993年9月在德国Dusseldorf海涅大学召开的41次世界药用植物研究年会上的大会发言中，10个为介绍植物提取物及成分的活性研究，其中7个的活性研究方式为体外活性测定［3］。 瑞典研究南美洲抗银屑病植物提取物Calaguala的过程可说明体外活性研究可起重要作用。南美洲蕨类植物Polypodium decumanum Willd的提取物Calaguala在当地长期用于治疗银屑病、特应性皮炎等皮肤疾患，以双盲法、安慰剂对照临床试验证明Calaguala对银屑病确有疗效。动物皮肤移植试验证明Calaguala可抗同种移植排斥，而免疫调节剂血小板活化因子（PAF）可引起同种移植排斥，并且与银屑病相关，故以PAF诱导的胞吐作用的体外活性测定为导向（中性粒细胞为供酶体、特异性PAF受体拮抗剂BN52021为阳性对照），对Calaguala做植化分离，先后在其中分离出有拮抗PAF受体活性的腺苷和1, 2-2 -O-十六酰-3-O-（6-硫-α-D-喹诺糖酰）-丙三醇，并证明后者还能剂量依赖性地引起［3H］ PAF从其受体移位，是类似于BN52021样的竞争性PAF受体拮抗剂。

体外试验证明Calaguala之中还存在着抑制PAF生物合成的化学成分，这样从抑制PAF方面解释了Calaguala抗银屑病的作用机制，还发现了新的PAF拮抗剂。

由于银屑病患者体内的5-LO活性大大高于正常人，故以体外5-LO活性抑制为导向（白细胞为供酶体、柳氮磺吡啶为阳性对照）同样做Calaguala的植化分离，分离出几个抑制5- LO产生LTB4的不饱和脂肪酸，又从抑制5-LO产生LTB4方面解释了C alaguala抗银屑病的作用机制。

同时以分出的具抑制5-LO活性的不饱和脂肪酸为母核，合成、半合成出一系列不同取代基、不同双键位置及构型的不饱和脂肪酸衍生物，仍以体外 5-LO活性抑制试验筛选活性成分，筛选开发5-LO抑制剂新药［4, 5］。

由此可见发达国家将体外生物测定研究用于传统植物药研究开发可一举数得，既阐明传统药的分子水平作用机制，以利于将其开发成为国际通用药物，又从中筛选出新的活性化合物，为开发合成药服务。

2 在合成药物研究开发中体外生物测定的应用

从植物药中筛选出活性母核后即进行结构改造，合成系列衍生物进行活性筛选，这种以药用植物成分做化学合成的模板的例子很多，而最常见的活性筛选方法为体外活性测定法。 黄酮普遍存在于多种植物中，其抗炎抗血栓形成等活性早已在体外和体内得到证实，研究证明黄酮类能够抑制几种类型的细胞的前列腺素合成酶(PGES)，故以体外方法研究黄酮为母核在不同位置上有不同取代基的32种合成化合物（21种黄酮衍生物、6种黄烷酮衍生物、5种儿茶酸衍生物）的抑制PGES活性。其研究结果确定出可抑制PGES的黄酮结构、筛选出有意义的活性母核，并且这些化合物还能被用于揭示一些酶的活性中心的结构。可见在发达国家开发传统药物和合成药物及医学基础研究紧密相关的程度及在这全过程中体外测定研究起的重要作用［ 6,

7］。

HIV病毒编码的蛋白酶抑制剂可以起到抗HIV的作用，体外试验占此类化合物的活性研究的很大部分。如在体外进行3个HIV蛋白酶抑制剂：利托那韦、沙奎那韦和印地那韦对人肝细胞微粒体中细胞色素同功酶催化代谢的抑制效应的实验。肝微粒体从肾移植供者的正常肝脏中制取，细胞色素P450同功酶的探针底物分别是非那西丁、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗和睾酮，用HPLC检测代谢产物。研究结果证明蛋白酶抑制剂对细胞色素P450酶的作用是有选择性的

［8］。

又如4-（4-环己基-2-甲基噁[ HT]唑-5）-2-氟苯基磺酰胺（JIE-522）是一种新型强效的COX-2选择性抑制剂。体外研究证明：该药能显著抑制大鼠腹腔巨噬细胞中COX-2依赖的PGE2的生成。而对COX -1依赖的PGE2生成抑制很弱［9］。

同样体外研究被应用在新近发展起来的组合化学技术中，体外试验可对大量化合物进行微量快速的活性追踪试验及分子水平、细胞水平的活性机制研究。

3 在西欧标准提取物研究开发中体外生物测定的应用

西欧标准提取物为发达国家以现代科技开发传统植物药成为国际通用药物的一个成功模式。迄今为止标准提取物中的佼佼者为银杏标准提取物、贯叶金丝桃标准提取物，在它们的研究开发中体外测定起着重要作用。

银杏标准提取物中占6%的一主要有效成分为银杏内酯类（其中活性最强的代表为银杏内酯B，即BN52021），它们为特异性PAF受体拮抗剂。大量报道BN52021与PAF受体特异性、竞争性的结合及它与PAF受体结合后抑制了PAF所引起的众多的生理作用，很多是以体外方式进行的［10］。

银杏标准提取物中占24%的另一主要有效成分为黄酮糖甙类，这类化合物具有清除自由基、抗过氧化、改善微循环、抗炎等活性。在体外用离体大鼠肝细胞以叔丁基过氧化物致毒，即引发脂质过氧化；以产生的丙二醛（MAD）量检测过氧化的水平，以二苯基苦基偕腙肼试剂脱色反应检测清除自由基活性。试验证明双黄酮、白果素、银杏素、异银杏素可极强地减少 MAD的产生，并具有较强的清除自由基活性。该体外试验还证明：对抗自由基和抗脂质过氧化作用主要由于中心吡喃环的C2-C3双键和B环邻位羟基的存在［11］。

体外研究发现金丝桃抑制MAO最强的部位含有的黄酮类化合物的浓度最高。金丝桃中的口 占吨酮成分在体外试验中也具有对M AOA强抑制活性。体外试验还证明金丝桃提取物抗

抑郁机制为：金丝桃浸膏可抑制5-羟色胺受体表达，金丝桃浸膏还可抑制5-羟色胺的吸收。 其他体外试验如：将金丝桃粗提物对39种受体和2种酶系统进行试验，其结果证明金丝桃粗提取对MAO具50%抑制活性，对腺嘌呤核苷、5-羟色胺、苯二氮zhuo、肌醇三磷酸及MAOAB等受体有明显的亲和性［12, 13］。

4 在日本汉方制剂现代化中体外生物测定的应用

日本的汉方医学起源于中国，在其发展过程中融合了日本民族的特点，汉方制剂处方绝大部分出自中国古代经典医著，以日本数一数二的汉方制剂公司津村汉方公司1996年产品介绍书列出的产品为例：全部134个汉方颗粒剂中97%处方出自中国古经典医著［14］。

日本的医疗体制自明治以来完全是西医的行政管理模式，医疗实践这一社会性行为也必须按照西医学的规范，医师只接受西医的系统教育，医疗保险也是以西医的疾病为单位进行的。传统医学只在部分医药科大学中作为选修课或讲座开设。但在这一社会条件下，近年来汉方颗粒剂的临床应用量却在大幅度地逐年上升，其主要原因之一是从70年代以来，日本按现代化的国际标准以现代医学理论和最新技术手段研究汉方制剂的作用机制。这一研究工作加速了日本汉方药与现代自然科学的融合汇通，也加快了其商品化及进入国际医药主流市场的进程（津村汉方颗粒剂产品的60%出口进入国际市场）。

在日本汉方药现代化的过程中，体外测定研究同样起着重要作用。以1996年日本津村汉方公司产品说明书为例：134个汉方颗粒剂中有21个颗粒剂说明书的药理药效项下出现34个各种体外测定研究的结果介绍。以在日本销售量最大的“小柴胡汤”为例，其药理、药效项下列出9项研究结果，其中整体动物研究结果为3项，即做整体动物研究又做体外活性测定的研究结果为5项，单做体外活性测定的研究结果为1项。可见在“小柴胡汤”的药理、药效研究中体外测定所占的比例［14］。