滴度计算:
根据荧光图片中GFP表达情况，比如，在加入1E-6 μl病毒原液的孔中观察到2个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有2个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，就是2/（1E-6）=2E+6，单位为TU/μl，也就等于2E+9 TU/ml。
如果是带有puromycin抗性的慢病毒，通过感染后的活细胞数量来判断滴度数值，如果在加入1E-5 μl病毒原液的孔中观察到3个细胞存活，说明该孔中至少有3个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，本例子中就是3/（1E-5）=3E+5，单位为TU/μl，也就等于3E+8 TU/ml。
3. Real time定量PCR法测定滴度 1) 样品制备
1. 检测前一天，对293T细胞传代，每个24孔中加１×105个细胞，体积为500 μl； 2. 次日，准备7~10个无菌的Ep管，在每个管中加入90 μl的培养基（DMEM+10% FBS）； 3. 取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10 μl加入到第二个管中。继续
相同的操作直到最后一管；
4. 选取所需的细胞孔，吸去90 μl培养基。加入稀释好的病毒溶液。放入37℃，5%CO2培
养箱中培养；
5. 24小时后，加入新鲜培养基500 μl。小心操作，不要吹起细胞，维持细胞正常生长； 6. 4天后，抽提RNA准备做RT-qPCR。 说明：
第一个Ep管中加入10μl病毒原液，记为1E+1 μl；
第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个Ep管中的1/10，记为1E+0 μl； 第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个Ep管中的1/10，记为1E-1 μl；
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依次类推…
第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原液为第六个Ep管中的1/10，记为1E-5 μl； 2) 总RNA抽提
说明：根据Invitrogen公司的TRIZOL操作说明书进行，均为RNase-free操作。
1. 去细胞上清，每孔加入１ml TRIZOL吹打，室温静置5 min，后转移至另一新的1.5 ml
eppendorf管中。
2. 每管加入200 μl氯仿，用力震荡15s，室温静置15 min。 3. 4℃，12000 rpm，离心15min。
4. 从每管中吸取上清至另一新的1.5 ml eppendorf管。加入等体积-20℃预冷的异丙醇，混
匀后-20℃沉淀 10 min。
5. 4℃，12000 rpm离心10 min后，去上清。
6. 加入至少1 ml 4℃预冷的75%乙醇，洗涤沉淀及离心管壁。 7. 4℃，10000 rpm离心5 min，弃上清。
8. 4℃，10000 rpm再次离心5 min，吸去残液，室温干燥（不需完全干燥）。 9. 加入20 μl RNase-free水，至完全溶解，紫外分析测定所抽提RNA的浓度。 3) RNA逆转录获cDNA
M-MLV逆转录酶和dNTP购自PROMEGA公司。Oligo dT购自上海生工。RNase -free的物品都购自Axygen。
说明：根据Promega公司的M-MLV操作说明书进行, 均为RNase－free操作。 Protocol:
1. 将1 μl Oligo dT(0.5μg/μl) 和2.0μg Total RNA加入到PCR小管中，补充DEPC-H2O
至9μl。混匀后离心，70℃温浴10min。 之后立即插入到0℃冰水浴中，使Oligo dT和
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模板退火。
2. 按下表的比例，根据反应管数算出所需的试剂量。将M-MLV酶等在冰上混匀，得到RT反
应液。
3. 在每个反应管中加入的11μl的RT反应液,混匀后离心。
试剂
5×RT buffer 10mM dNTPs RNasin M-MLV-RTase DEPC H2O
每管加入量 4 μl 2 μl 0.5 μl 1 μl 3.5 μl
4. RT反应在42℃进行1hour后完成，之后用70℃处理10min使RT酶失活。 5. 得到的RT反应产物-cDNA 可立即用于PCR，也可保存在-80℃以后使用。 4) Real-time PCR检测
Real-time PCR在TAKARA的TP800上完成。SYBR Master Mixture来自TAKARA. 1. 按下列比例配置反应体系 ：
试剂
SYBR premix ex taq: 上游引物（5μM）： 下游引物（5μM）： cDNA 水
每管加入量 10 μl 1.0μl 1.0μl 1.0μl 7.5 μl
2. 设定程序为两步法Real-Time定量。预变性95℃，15S，之后每一步变性95℃，5S,退火
延伸60℃，30S,共进行40个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。
Cycle 1: (1X)
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Step 1: 95.0 ℃ for 00:15.
Cycle 2: (40X) Step 1: Step 2:
95.0 ℃ 60.0 ℃
for 00:05. for 00:30.
Data collection and real-time analysis enabled.
3. 制作熔解曲线。PCR结束后，在95℃变性1min。然后冷却至55℃，使DNA 双链充分结
合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持30S, 同时读取吸光值。
Cycle 3: (1X) Step 1:
95.0 ℃
for 01:00.
Cycle 4: (1X) Step 1:
55.0 ℃
for 01:00.
Cycle 5: (81X) Step 1:
55.0 ℃-95.0 ℃
for 00:30.
Increase set point temperature after cycle 2 by 0.5 ℃
示例: Real-time定量PCR法测定GFP-tagged慢病毒滴度 引物信息： GFP引物: 被扩增的片段位置： 上游引物序列： 下游引物序列：
211bp-496bp
TGCTTCAGCCGCTACCC AGTTCACCTTGATGCCGTTC
Tm 57.4 57.3
GC% 64.7 50.0
ACTIN引物:（NM_001101） 被扩增的片段位置：
932bp-1233bp
Tm
GC%
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上游引物序列： 下游引物序列：
GTGGACATCCGCAAAGAC AAAGGGTGTAACGCAACTA
52.6 51.0
55.6 42.1
Real-time定量PCR结果： 下图为实时定量PCR曲线图：
具体数值：
样品 1.00E+0μl 1.00E-1μl 1.00E-2 μl 1.00E-3 μl 1.00E-4 μl control 注：曲线颜色和样品颜色相同。
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Actin Ct值 16.72 16.49 16.52 16.34 16.48 16.26 GFP Ct值 18.51 18.55 21.69 21.61 24.80 24.71 28.52 28.54 30.61 30.69 32.50 32.47 GFP Ct均值 18.53 21.65 24.75 28.53 30.65 32.485
过表达慢病毒载体构建和包装手册 version1 - 图文
