三、 Lentivirus病毒包装
1. 转染前24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度为1.2 x 107细胞/20 ml，重新接种于15 cm细胞培养皿，37 ℃ 、 5% CO2 培养箱内培养。24 h待细胞密度达70%～80%时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。 2. 转染前2 h将细胞培养基更换为无血清培养基。
3. 向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pGC-LV载体 20 μg ，pHelper 1.0载体15 μg，pHelper 2.0载体10 μg)，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为 2.5 ml，在室温下温育5分钟。
4. 将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取100 ?l Lipofectamine 2000试剂在另一管中与2.4 ml Opti-MEM混合，在室温下温育5分钟。
5. 把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。必须在5分钟之内混合。
6. 混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液的转染复合物。
7. 将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37 ℃, 5% CO2细胞培养箱中培养。
8. 培养8 h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20 ml的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。
9. 每瓶细胞中加入含10% 血清的细胞培养基25 ml，于37 ℃ 、 5% CO2 培养箱内继续培养48小时。
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四、 病毒的收获及浓缩
1． 收集转染后48小时（转染即可为0小时计起）的293T细胞上清液。 2． 于4 ℃，4000 g 离心10 min，除去细胞碎片。 3． 以0.45 μm滤器过滤上清液于40 ml超速离心管中。
4． 把病毒粗提液样品加入到过滤杯中（最多19 ml），盖上盖子。将过滤杯插到滤过液收集
管中。
5． 组合好后，做好平衡，放在转头上。
6． 在4000 × g离心，至需要的病毒浓缩体积。通常需要的时间为10-15分钟。 7． 离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开。
8． 将过滤杯倒扣在样品收集杯上。
9． 离心力不超过1000g,时间为2分钟。过高转速会导致样品损失。把过滤杯从样品收集杯
上移开。样品收集杯中的即为病毒浓缩液。
10． 将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80度长期保存。取其中一支进行病毒生物
学滴度测定。
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[详情登陆www.millipore.com/网站，查看Centricon Plus-20，P31925信息]
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五、 Lentivirus滴度测定
1. 荧光法测定滴度
1)测定前一天，为测定滴度所需的细胞（吉凯基因公司用的293T细胞：贴壁生长）铺板，96孔板，每个孔加4×104个细胞，体积为100 μl。
2)根据病毒的预期滴度，准备7~10个无菌的Ep管。在每个管中加入90 μl的无血清培养基。 3)取待测定的病毒原液10 μl加入到第一个管中，混匀后，取10 μl加入到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管。
4)选取所需的细胞孔，吸去90 μl培养基，丢弃。加入90 μl稀释好的病毒溶液。放入培养箱培养。
5)24小时后，加入完全培养基100 μl。小心操作，不要吹起细胞。 6)4天后，观察荧光表达情况。荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少
2. 药筛法测定滴度
1~5步骤与“1）荧光法测定滴度”相同，感染后48小时加入抗性药物（puromycin, Sigma-Aldrich, Cat. P9620），维持药物浓度在5 μg/ml。继续培养2天，观察细胞生长状况。
样品说明：
第一个Ep管中加入10ul病毒原液，记为1E+1 μl；
第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个Ep中的1/10，记为1E+0 μl； 第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个Ep中的1/10，记为1E-1 μl； 依次类推…
第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原液为第六个Ep中的1/10，记为1E-5 μl；
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第八个Ep管中进行了第七次十倍稀释，所得病毒原液为第七个Ep中的1/10，记为1E-6 μl；
滴度荧光照片：[仅供参考]
样品组 明视野 100x 荧光视野 100x
1E+0 μl
1E-1 μl
1E-2 μl
1E-3 μl
1E-4 μl
1E-5 μl
1E-6 μl
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过表达慢病毒载体构建和包装手册 version1 - 图文
