Query 1284 GATGGATGAGAAGAGCGAGGAGGGGAAGGCAGCCGCCTCCCAAGAGAAGTCACGAAGAGT 1343 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1304 GATGGATGAGAAGAGCGAGGAGGGGAAGGCAGCCGCCTCCCAAGAGAAGTCACGAAGAGT 1363
Query 1344 AAAAGAAGAGAACTCAGAGATCTCGGTGAATGCTGGTGGCATCCCTGAGCAAATACAGTC 1403 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1364 AAAAGAAGAGAACTCAGAGATCTCGGTGAATGCTGGTGGCATCCCTGAGCAAATACAGTC 1423
Query 1404 TCTCTCTGTGCACGACTCTCAGGCCCAACCAAACGCTAATGAAGACTACAGAGAAGGTCC 1463 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1424 TCTCTCTGTGCACGACTCTCAGGCCCAACCAAACGCTAATGAAGACTACAGAGAAGGTCC 1483
Query 1464 TTGTGCAGTCAACCTTGTTTTAAGATTAAGAAACTCCAGAAAGGAACTTAATGACATACG 1523 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1484 TTGTGCAGTCAACCTTGTTTTAAGATTAAGAAACTCCAGAAAGGAACTTAATGACATACG 1543
Query 1524 ATTTGAGTTTACTCCAGGAAGAGATACAGCAGACGGTGTGTCTCAGGAGCTCTTCTCTGC 1583 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1544 ATTTGAGTTTACTCCAGGAAGAGATACAGCAGACGGTGTGTCTCAGGAGCTCTTCTCTGC 1603
Query 1584 TGGCTTGGTTGACGGCCATGATGTAGTTATAGTGGCTGCTAATTTACAGAAGATTGTAGA 1643 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1604 TGGCTTGGTTGACGGCCATGATGTAGTTATAGTGGCTGCTAATTTACAGAAGATTGTAGA 1663
Query 1644 TGACCCCAAAGCTTTAAAAACGTTGACATTTAAGTTGGCTTCTGGCTGCGATGGGTCGGA 1703 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1664 TGACCCCAAAGCTTTAAAAACGTTGACATTTAAGTTGGCTTCTGGCTGCGATGGGTCGGA 1723
Query 1704 GATTCCTGATGAAGTGAAGCTGATCGGGTTCGCCCAGTTGAGTGTGAGC 1752 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1724 GATTCCTGATGAAGTGAAGCTGATCGGGTTCGCCCAGTTGAGTGTGAGC 1772
比对说明：Query是我们得到的测序结果；Sbjct是目标基因序列；Identities =100%，说明测序结果与目标序列完全一致
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第二部分 慢病毒包装与滴度检测
一、 实验流程
制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，按 Invitrogen公司Lipofectamine 2000使用说明进行共转染293T细胞，转染后8 h 更换为完全培养基，培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，在293T细胞中测定并标定病毒滴度。在一定滴度范围内的慢病毒颗粒可以满足大部分体内体外实验需求，流程图见Fig.6。
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二、 实验材料
1. 细胞株
293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 2. 菌株
大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 3. 病毒载体 1) GV载体图谱：
[具体结构请参考“第一部分 过表达慢病毒载体的制备”] 2) pHelper 1.0载体图谱：
3) pHelper 2.0载体图谱：
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DNA溶液的制备：以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取慢病毒包装系统中三种质粒DNA，质粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒DNA 的A260/A280在1.8～2.0之间。
4. 试剂
试剂名称 台盼兰 胎牛血清 FBS
DMSO DMEM 胰酶
Lipofectamine 2000 5. 仪器
仪器名称 荧光显微镜 CO2培养箱
仪器来源 奥林帕斯 日本三洋 SANYO
Cat.No.
micropublisher 3.3RTV
MCO-175
试剂来源
上海捷倍思基因技术有限公司 上海微科生化试剂有限公司
上海生物试剂厂
GIBCO 上海化学试剂公司 Invitrogen
Cat.No.
A11-102
12800-017
11668-500
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生物安全柜 Plus-20离心超滤装置
上海振样创空气净化设备有限公司
MILLIPORE
Bio 1200-Ⅱ-A2 ufc910024
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过表达慢病毒载体构建和包装手册 version1 - 图文
