7) 倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。
8) 每50 ml初始培养物用2 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2重悬每份细胞沉淀。 9) 将细胞分装成小份，放于-70oC冻存。
（感受态细胞制备参考：分子克隆实验指南第二版55页）
1.3.3 转化：
1) 用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200 μL转移到无菌的微量离心管中，每
管加10 μL 连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。
2) 将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的EP管架上，恰恰放置90秒，不要摇动EP管
架。
3) 快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却l—2分钟。
4) 每管加800 μL LB培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，
温育45分钟使细菌复苏。
5) 将150 μL已转化的感受态细胞转移到AMP抗性（100ug/ml）的 LB琼脂培养基上。 6) 将平板置于室温直至液体被吸收。 7) 倒置平皿，于37℃培养，16小时。 8) 长出的克隆进行后续PCR鉴定。
（转化操作参考：分子克隆实验指南第二版55-56页）
1.4 阳性克隆的PCR鉴定 1.4.1 引物
ID Stk39-SEQF EGFP-N-R seq CGGTGAATGCTGGTGGCATC TCACCATGGTGGCGACCGGGCTCACACTCAACTGGGC 11/ 33
引物说明：本对引物一个位于目的基因中，一个位于载体上，用于菌落PCR鉴定转化子
1.4.2 PCR鉴定
PCR反应体系：
试剂 体积（μL） ddH2O 5×Taq buffer dNTPs (2.5mM) Primer（+）（10μM） Primer（-）（10μM） Template Taq polymerase PCR反应条件：
12.4 4 1.6 0.4 0.4 1 0.2 94℃ 3 min 94℃ 30 sec 60℃ 30 sec 72℃ 30 sec 72℃ 5 min 4℃ ∞
30 cycle
1.4.3 PCR结果
PCR产物电泳图 12/ 33
1 2 3 4 5 6 7 8
样品说明：
泳道 1# 2# 3# 4# 样品编号 阴性对照（ddH2O） 阴性对照（空载自连对照组） 阳性对照（GAPDH） Marker：5 kb，3 kb，2 kb，1.5 kb，1 Kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp 5# ～8＃ Stk39-1～4号转化子 接种阳性转化子，37℃培养16小时后保存为甘油菌，分装200μL送测序
1.5 阳性克隆测序结果及结果分析：
>ref|NM_016866.2| homolog (yeast) (Stk39), mRNA
Mus musculus serine/threonine kinase 39, STE20/SPS1
gb|BC064443.1| Mus musculus serine/threonine kinase 39, STE20/SPS1 homolog (yeast),
mRNA (cDNA clone MGC:69607 IMAGE:6843981), complete cds
Length=3268
13/ 33
GENE ID: 53416 Stk39 | serine/threonine kinase 39, STE20/SPS1 homolog (yeast) [Mus musculus] (Over 10 PubMed links)
Score = 3083 bits (1669), Expect = 0.0
Identities = 1669/1669 (100%), Gaps = 0/1669 (0%) Strand=Plus/Plus
Query 84 CATGGCGGAGCCGAGCGGCTCGCCTGTGCACGTCCAGCTTTCCCAGCAggcggccccggt 143 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 104 CATGGCGGAGCCGAGCGGCTCGCCTGTGCACGTCCAGCTTTCCCAGCAGGCGGCCCCGGT 163
Query 144 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 164 GACAGCGGCGGCGGCGACGGCCCCGGCGGCCGCGACATCAGCACCAGCCCCGGCCCCGGC 223
Query 204 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 224 CCCGGCTCCGGCGGCGTCCGCAGCCCCGGCCCCGGCTCCAGCTGCTGCTCCAGCCCCGGC 283
Query 264 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 284 CCCGGCAGCTCAGGCGGTCGGCTGGCCCATCTGCAGGGACGCGTACGAGCTCCAGGAGGT 343
Query 324 TATCGGCAGCGGAGCAACTGCGGTGGTTCAGGCAGCCCTATGCAAACCCAGGCAAGAACG 383 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 344 TATCGGCAGCGGAGCAACTGCGGTGGTTCAGGCAGCCCTATGCAAACCCAGGCAAGAACG 403
Query 384 CGTAGCCATAAAGCGGATCAACTTGGAAAAATGCCAGACGAGTATGGATGAACTCCTGAA 443 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 404 CGTAGCCATAAAGCGGATCAACTTGGAAAAATGCCAGACGAGTATGGATGAACTCCTGAA 463
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Sbjct 464 AGAAATTCAAGCCATGAGCCAATGCAGCCATCCCAACGTAGTGACTTATTACACCTCCTT 523
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Sbjct 584 TATCATCAAATACATCGTTAATCGAGGAGAACATAAAAATGGTGTCCTAGAAGAGGCGAT 643
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203 263 Query 624 AATTGCAACAATTCTTAAGGAGGTTTTGGAAGGTTTAGACTATCTGCACAGAAACGGTCA 683 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 1064 GTCCTTCAGAAAGTTACTGTCACTGTGTCTTCAGAAAGATCCTTCCAAAAGGCCCACAGC 1123
Query 1104 AGCAGAACTTTTAAAATGCAAGTTCTTCCAGAAAGCCAAGAACAGAGAGTACCTGATCGA 1163 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 1184 GAAGCTGCTGACAAGAACCCCAGACATAGCCCAAAGAGCCAAGAAGGTAAGGCGAGTTCC 1243
Query 1224 TGGGTCGAGCGGTCACCTTCATAAGACTGAAGACGGCGACTGGGAGTGGAGCGATGACGA 1283 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1244 TGGGTCGAGCGGTCACCTTCATAAGACTGAAGACGGCGACTGGGAGTGGAGCGATGACGA 1303
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过表达慢病毒载体构建和包装手册 version1 - 图文
