三、 过表达克隆制备
——以STK39基因为例描述详细实验过程
1. 基因信息：
Symbol： Accession： Organism：
STK39 NM_013233 Human
Description： Homo sapiens serine threonine kinase 39 (STK39), mRNA. 2. 工具载体:
载体图谱 载体说明 载体编号：GV208 元件顺序：Ubi-MCS-EGFP 荧光标记：EGFP 真核抗性： 克隆位点：AgeI 3. 载体酶切： 酶切反应温度：37℃ 酶切反应时间：2 h 酶切反应体系：
试剂 ddH2O 10×buffer 1 6/ 33
体积 42 μL 5 μL 纯化的DNA质粒（1 ug/μL） Age I （5 U/μL） Total 2 μL 1 μL 50 μL 1.1.1 载体酶切结果：
载体酶切电泳图谱 1#: Marker (条带从上到下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp) 2#: GV208 Vector 3#: Age I digested GV208 Vector 电泳图说明 1.2 目的基因片段的获取 1.2.1 引物
ID Stk39-Age I-F seq GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCGGAGCCGAGCGGC Stk39- Age I-R TCACCATGGTGGCGACCGGGCTCACACTCAACTGGGC 引物说明：含交换配对碱基、酶切位点（下划线标记的），表达增强序列（双下划线记的）以及目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因
1.2.2 PCR扩增目的基因片段
PCR反应体系：
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试剂 ddH2O 5×Taq buffer dNTPs (2.5mM) Primer（+）（10μM） Primer（-）（10μM） Template（10ng/μL） Taq polymerase 体积（μL） 12.4 4 1.6 0.4 0.4 1 0.2 PCR反应条件：
94℃ 5 min 94℃ 30 sec 55℃ 30 sec 72℃ 2 min 72℃ 10 min 4℃ ∞
30 cycle
1.2.3 PCR结果
PCR产物电泳图 电泳图说明 1 2 1#：PCR产物 2#：Marker 从上至下依次为5 kb，3 kb，2 kb，1.5 kb，1 Kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp 8/ 33
1.3 重组质粒构建
模式图
1.3.1 PCR产物交换入线性化表达载体
反应条件：
25℃ 30分钟 → 42℃ 15分钟
反应体系：
反应体系(μL):
dd H2O
10 ×In-Fusion交换酶缓冲液
In-Fusion交换酶 线性化载体DNA 纯化后PCR产物片段
阳性对照 17.5-X-Y
2 0.5 X Y
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自连对照 17.5-X 2 0.5 X 0
实验组 17.5-X-Y
2 0.5 X Y
说明：
Total 20 20 20
a) 加入的线性化载体DNA和纯化的PCR产物的摩尔数比例为：1：3~1：9之间 b) 阳性对照加入的纯化的PCR产物为GAPDH基因（同样带有交换臂）
1.3.2 制备感受态细胞：
配置下述溶液：
1) 0.1M CaCl2溶液，以0.22μm过滤除菌。 2) 250mM KCl2溶液。 3) 2M MgCl2溶液，高压灭菌。
4) SOB: 1ml 250mM KCl2溶液加入100ml LB，以5M NaOH 调PH值至7.0，高压灭
菌，临用前加入0.5ml 2M MgCl2溶液。 用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞
1) 从于37oC培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有 100 ml LB培养基
的 1 L烧瓶中。于 37oC剧烈振摇培养 3 小时(旋转摇床，300转／分)。
2) 在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在
冰上放置 10分钟，使培养物冷却至 0oC。 3) 于4 oC, 以4000转／分离心 10分钟，回收细胞。
4) 倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。
5) 以 10 ml用冰预冷的 0.1 mol／L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。 6) 于4oC，以4000转／分离心10分钟，回收细胞。
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过表达慢病毒载体构建和包装手册 version1
