过表达慢病毒载体构建和包装手册
Version1.0
吉凯基因
二零一一年五月
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目 录
简 介……………………………………………………………………3 第一部分 过表达慢病毒载体的制备
实验流程……………………………………………………………4 实验材料…………………………………………………………5 过表达克隆制备……………………………………………………6 第二部分 慢病毒包装与滴度检测
实验流程……………………………………………………………17 实验材料……………………………………………………………18 Lentivirus病毒包装………………………………………………21 病毒的收获及浓缩…………………………………………………22 Lentivirus滴度测定………………………………………………24 参考文献………………………………………………………………33
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简 介
慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。
吉凯基因慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。
吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装，获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒，以满足不同的实验需求。
本手册为吉凯基因RNAi慢病毒载体的构建和病毒包装的通用操作流程，目的是为了方便大家交流使用，部分细节内容未能做到一一详述，敬请谅解。同时希望大家能够针对手册中的错误和问题，提出宝贵的意见。
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第一部分 过表达慢病毒载体的制备
一、 流程图
从含有目的基因的质粒中，利用PCR方法钓取目的基因，将目的载体进行酶切，酶切产物电泳回收后进行交换，其产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定，再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的即为构建成功的目的质粒。
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二、 实验材料描述
a) 主要试剂
试剂名称
1kp DNA ladder Marker 250bp DNA ladder Marker
琼脂糖 限制性内切酶
In-Fusion? PCR Cloning Kit
Taq polymerase
dNTP Primer Plasmid 抽提 Kit
试剂来源 Fermentas公司
捷瑞公司 赛百盛公司 NEB公司 clontech SinoBio Takara 捷瑞生物 Promega
cat.No. #SM0311 DL250+,100T GA4-100 R0136V 639626 E001-02B D4030A
A1460
b) 主要仪器
仪器名称 PCR仪
positive clone 测序 稳压DNA电泳仪 凝胶成像仪 细菌摇床 细菌培养箱 Gilson移液器 高速离心机
仪器来源
Applied Biosystems公司
美季生物技术 BioRad公司 天能公司 华利达实验设备公司 上海一恒科学仪器有限公司
吉尔森公司 日立公司
cat. No. 2720 thermal
cycler ABI3730型
HI-9211K
TGL-16G-A
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