自身免疫病治疗中SiRNA的研究进展
关键词 RNA干扰,siRNA,基因沉默,自身免疫病
摘要 RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种由小双链RNA有效地作用于同源RNA序列诱发的“基因沉默”,在探查基因功能和治疗人类疾病方面有广阔的应用前景。小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)是RNAi的主要介导者,它通过双链RNA(dsRNA)使同源基因沉默,也是最广泛使用的以核酸为基础来治疗疾病的基因沉默技术。如今,siRNA已被应用于诸多研究领域,其在自身免疫病(如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化等)中的研究也日益增多。本文将对siRNA的发现、siRNA介导的基因沉默机制以及siRNA在自身免疫性疾病治疗中的应用进行综述。 [中图分类号][文献标识码]A
The Progress of siRNA in Autoimmune Diseases Treatment [Abstract] RNA interference (RNAi) is a process which induce gene silencing by small double-stranded RNA acting on its homologous RNA sequences and has broad application prospects in the exploration of gene functions and treatment of human diseases. SiRNA is one of the small RNA molecules which are central to RNA interference and is the most extensively used gene-silencing technique among the other nucleic-acid based treatment approaches. Nowadays, siRNA has been applied in many fields and also plays more and more important roles in autoimmune diseases, such as rheumatoid arthritis, multiple sclerosis and systemic lupus erythematosus, etc. This review intends to give the reader an overview of the regulatory roles and applications of siRNA in autoimmune diseases as well as the discovery of it, the mechanism of its mediating gene silencing.
[Keywords] RNA interference,siRNA,gene silencing,autoimmune disease
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指外源双链RNA进入细胞,可引起与其序列相同的转录基因mRNA降解的现象。双链RNA分子在RNA酶Ⅲ核酸内切酶Dicer的作用下,被切割产生含21~23个核苷酸(nt)的小双链RNA片段,称小干扰RNA(small interfering RNAs, siRNA)。它的作用是在mRNA水平关闭相应序
列基因的表达或使其沉默的过程,即转录后基因沉默。目前,siRNA是最广泛使用的、以核酸为基础的、治疗疾病的基因沉默技术。已报道的运用siRNA可治疗的疾病包括:癌症、肝炎、呼吸道疾病、心血管疾病、神经元疾病以及自身免疫病。 1 siRNA的发现与作用机制 RNA干扰的发现
1998年,线虫基因组测序工作完成后,Andrew Fire和Craig Mello首次提出了一项新技术:通过双链RNA(dsRNA)诱导特异基因的沉默,即RNA干扰。这些双链RNA是在体外转录正义RNA时所生成。1999年,Andrew Hamilton 和David Baulbe随后发现,在拟南芥的转基因株和病毒诱导的转录后的基因沉默中,存在21-25 nt的RNA,该RNA与沉默基因序列互补,其来源是较长的双链RNA前体,这些小分子双链RNA即被称为siRNA。20XX年,Elbashir等首次报道siRNA可特异性阻抑哺乳动物细胞靶基因表达,自此,siRNA作为一种新兴的基因沉默技术被广泛运用于生物学和医学等研究领域。
基金项目:上海市教委科研创新重点项目(12ZZ103),上海市卫生局科技发展基金(20XX177),
上海市教委重点学科(J50207)
作者简介:赵晴(1989-),女(汉族),江苏南通人,硕士研究生 通讯作者:陈广洁
siRNA在基因沉默中的作用机制
细胞内的dsRNA(可以是来源于实验导入的、异常表达的转基因,RNA病毒,转座子或者短的内源发夹RNA分子)特异性与Dicer结合,以ATP依赖的方式被切割成siRNA。被Dicer酶切割成的siRNA具有相似的结构特征:长度为21-23 nt的双链RNA,带有3’ 端单链尾巴及磷酸化的5’ 端,互补双链的3’ 端均有2-3nt的单链突出。siRNA中的一条链与蛋白复合物结合后形成RNA诱导沉默复合物(RNA Induced Silencing Complex, RISC),同时解链,正义链离开,然后反义链在ATP的作用下,通过碱基互补配对原则与同源的靶mRNA结合,在核酸内切酶的作用下,将靶mRNA切断,从而阻断其翻译成蛋白质,达到基因沉默的目的。RISC是一种核酸和蛋白质的复合物,包括蛋白质和siRNA,已经在果蝇和人类细胞中得到纯化。另一种情况是,siRNA与mRNA结合后,在依赖于RNA的聚合酶作用下以mRNA为模板、siRNA为引物指导合成dsRNA,然后Dicer酶再切割,导致mRNA降解。
一些研究证明,siRNAs还有其他沉默机制,例如在几种生物中能够通过RNAi途径修饰细胞染色质导致转录水平的基因沉默。 2 siRNA技术
siRNA的合成方法
目前较为常用的制备siRNA的方法有5种,包括:(1)化学合成:这是最初研究RNAi时所采用的方法,设计siRNA序列后,由合成仪按照序列进行合成,再进行后续的纯化。(2)体外转录:这种方法采用T7 RNA聚合酶,以先合成的DNA链为模板分别转录合成正义和反义RNA,将正义和反义RNA混合。再经退火复性得到dsRNA,从而使合成 dsRNA的成本大大降低。(3)长片段dsRNA经酶降解:根据siRNA形成的原理,首先针对靶基因的mRNA在体外转录合成长的dsRNA。然后在体外用Dicer酶(或者RNase)消化。这样就形成了含有多个针对目的基因的2l bp的siRNA混合物,再将该混合物转染至细胞。(4)siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNA:先在体外构建能表达dsRNA的载体,再将其转移到细胞内,合成dsRNA;(5)聚合酶链式反应(PCR)制备的siRNA表达框在细胞中表达:是一种由PCR得到的siRNA表达模板。包括一个RNApol Ⅲ启动子、一段发夹结构siRNA和一个RNApol III终止位点,能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。前3种方法经过体外制备siRNA,然后应用专门的RNA转染试剂将其转染到细胞内,或者采用电转染法将其导入哺乳动物细胞;后两种方法不需要直接操作RNA,依赖能够表达siRNA的DNA载体或者基于PCR的表达载体转染到细胞中,通过转染到细胞的DNA模板在体内的转录得到siRNA。 siRNA导入哺乳动物细胞的策略
在哺乳动物细胞中通常通过RNAi阻断特定基因的表达,从而可研究相关基因的功能。此研究的基础在于成功地将siRNA导入细胞。常见的导入策略是将靶向特定基因的约21碱基长短的双链siRNAs,或者45-50-mer的发夹结构RNA(small hairpin RNA, shRNA)转染到细胞内。此外,通过质粒表达siRNAs同样可以抑制特定基因的表达。
3 siRNA在自身免疫病治疗中的应用
类风湿性关节炎类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病,慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为其主要的临床表现。
目前,类风湿性关节炎的确切病因还未完全阐明,但一些研究证实,细胞因子在软骨和骨侵蚀中有重要的作用,如TNF-α和IL-1。用抗TNF-α和抗IL-1的单克隆抗体治疗,可显着降低软骨和骨侵蚀。天然的IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)已在类风湿性关节炎体内模型中使用。IL-1Ra的基因治疗可显着减少实验性类风湿性关节炎模型小鼠的关节损伤。
运用siRNA技术沉默疾病相关基因的表达,对类风湿性关节炎的治疗也具有广泛的应用前景。如siRNA沉默树突细胞中的CD40、CD80和CD86,可抑制
自身免疫病治疗中SiRNA的研究进展
