(1)、 真核mRNA的分离纯化
特点:含量少,不均一,表达具有发育阶段性和组织特异性。 总RNA: rRNA 80~85% mRNA 1~5% tRNA及其它小分子RNA 10~15% 不均一:在1~5%的mRNA中,有10000—30000种mRNA。 分离、纯化:
用Oligo dT纤维素柱(亲和层析法),加入总RNA,高盐洗脱,先流出非mRNA,降低盐浓度,加入Oligo dA竞争,可洗出mRNA 混合物。
免疫法可分离特定的mRNA。 (2)、 cDNA合成(反转录酶) A. 自身引物法(S1核酸酶降解法) 图
Oligo(dT)15-18个核苷酸 mRNA5’端序列有丢失。 B. 取代合成法(较常用) 图
Oliyo(dT)与mRNA3’端AAA杂交作为引物,合成第一条DNA链。 RNaseH在mRNA上产生多个切口。
DNA pol.Ⅰ切口平移,DNA ligase连接,合成出第二条DNA链。 T4DNA pol.切去端头的RNA-DNA杂交链。 C. 引物合成法
可以合成全长cDNA,mRNA的5’端不丢失。 图
(3)、 cDNA与载体连接 (4)、 重组体的转化 (5)、 扩增、保存
2、 获取特定mRNA的cDNA
(1)免疫法分离特定的mRNA (2)PCR法
二、 PCR技术(聚合酶链式反应)
Polymerase chain Reaction
以目的基因或DNA片段为模板,在引物介导及Taq DNA聚合酶催化下,在体外用核苷酸大量合成目的基因或DNA片段。
它能快速、专一地扩增所希望得到的目的基因或DNA片段。
1、 反应物
(1)模板
单、双链DNA或cDNA都可以作为PCR的模板,若以RNA为起始材料,则须经反转录,获得第一条cDNA后才能用于PCR。
(2)Taq DNA聚合酶
DNA聚合酶是进行PCR扩增的关键,从水生栖热菌(Thermus aquaticns VT-1)分离出来。
Taq DNA聚合酶有很好的热稳定性,92.5℃处理130min,仍保留50%的酶活性,在74℃活性最高,错误掺入核苷酸的比率为1/7500。
(3)引物
引物是决定PCR结果的关键,它由寡核苷酸组成,15-30个b (4)核苷酸dNTP
dNTP的浓度50-200umul/L。 (5)镁离子Mg2+
2、 PCR原理
图
变性 95℃ 复性 55℃ 延伸 72℃
第十三章DNA的复制和修复
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