（1）、 真核mRNA的分离纯化
特点：含量少，不均一，表达具有发育阶段性和组织特异性。 总RNA： rRNA 80~85% mRNA 1~5% tRNA及其它小分子RNA 10~15% 不均一：在1~5%的mRNA中，有10000—30000种mRNA。 分离、纯化：
用Oligo dT纤维素柱（亲和层析法），加入总RNA，高盐洗脱，先流出非mRNA，降低盐浓度，加入Oligo dA竞争，可洗出mRNA 混合物。
免疫法可分离特定的mRNA。 （2）、 cDNA合成（反转录酶） A. 自身引物法（S1核酸酶降解法） 图
Oligo(dT)15-18个核苷酸 mRNA5’端序列有丢失。 B. 取代合成法（较常用） 图
Oliyo（dT）与mRNA3’端AAA杂交作为引物，合成第一条DNA链。 RNaseH在mRNA上产生多个切口。
DNA pol.Ⅰ切口平移，DNA ligase连接，合成出第二条DNA链。 T4DNA pol.切去端头的RNA-DNA杂交链。 C. 引物合成法
可以合成全长cDNA，mRNA的5’端不丢失。 图
（3）、 cDNA与载体连接 （4）、 重组体的转化 （5）、 扩增、保存
2、 获取特定mRNA的cDNA
（1）免疫法分离特定的mRNA （2）PCR法
二、 PCR技术（聚合酶链式反应）
Polymerase chain Reaction
以目的基因或DNA片段为模板，在引物介导及Taq DNA聚合酶催化下，在体外用核苷酸大量合成目的基因或DNA片段。
它能快速、专一地扩增所希望得到的目的基因或DNA片段。
1、 反应物
（1）模板
单、双链DNA或cDNA都可以作为PCR的模板，若以RNA为起始材料，则须经反转录，获得第一条cDNA后才能用于PCR。
（2）Taq DNA聚合酶
DNA聚合酶是进行PCR扩增的关键，从水生栖热菌（Thermus aquaticns VT-1）分离出来。
Taq DNA聚合酶有很好的热稳定性，92.5℃处理130min，仍保留50%的酶活性，在74℃活性最高，错误掺入核苷酸的比率为1/7500。
（3）引物
引物是决定PCR结果的关键，它由寡核苷酸组成，15-30个b （4）核苷酸dNTP
dNTP的浓度50-200umul/L。 （5）镁离子Mg2+
2、 PCR原理
图
变性 95℃ 复性 55℃ 延伸 72℃
第十三章DNA的复制和修复
