利用重组酵母菌生产人类胰岛素 某某人 114204XXXX
摘要：利用PCR技术合成重组人胰岛素基因，并在A链和B链之间加入Kex2酶
切位点。将合成的重组人胰岛素基因以正确的阅读框插入到组成型分泌表达载体
α
pGAPZ-A的α-factor信号肽序列的下游，构建成pGAPZα-A/Insulin重组分泌表达载体。表达载体用Bln I线性化处理后电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞，构建成分泌型表达Insulin的工程菌。SDS2PAGE和Native2PAGE电泳说明A链跟B链是否正确地进行了切割并形成有高级结构的重组人胰岛素。WesternBlot结果表明：重组蛋白是否能够与鼠抗人Insulin抗体发生特异性反应而具有与天然Insulin相同的免疫原性。通过单因素分析和正交实验法对巴斯德毕赤酵母的高密度发酵培养基进行了筛选和优化；对高效表达人生长激素的培养条件进行了优化；根据优化的摇瓶发酵结果进行了补料分批发酵；对表达产物进行了初步鉴定。
关键词：重组人胰岛素，毕赤酵母，分泌表达，培养基优化，晶体收集 Use recombinant pasteris to produce human insulin Name：Unknown
Abstract：Use PCR synthesis of recombinant human insulin gene, join Kex2 cleavage sites between the A and B chains. The synthetic recombinant human insulin gene in the correct reading frame was inserted into the constitutive secretory expression vector pGAPZα-A α-factor signal peptide sequence Preparation the construct pGAPZα-A/Insulin recombinant secretory expression vector. The expression vector linearization Bln I treated electroporation competent cells of Pichia pastoris GS115 constructed expression of secretory Insulin engineered bacteria.The analysis SDS2PAGE and Native2PAGE showed that A and B chains have already been cut correctly or not to form the recombinant human insulin with correct advanced structure or not.WesternBlot: The results show that the recombinant protein was able to specifically react with mouse anti-human Insulin Antibodies having the same natural Insulin immunogenicity or not. By single factor analysis and orthogonal experiment method of high density fermentation of Pichia pastoris medium screening and optimization; optimized culture conditions of the high-level expression of human growth hormone; according flask fermentation optimization results the fed-batch fermentation; preliminary identification of the expression product. Key words：recombinant human insulin, Pichia pastoris, secretion of expression, media optimization, crystal collection 引言：利用重组酵母菌生产人类胰岛素在实验室中成功的案例已经被报道。通过分别构建重组人类胰岛素A链和B链的质粒来转染毕赤酵母的方法来获得分泌型表达人insulin的工程菌，并通过尿素-SDSPAGE电泳和Westernblot的方式来鉴定获得的重组蛋白是否形成正确的结构并具有生物学活性。并通过单因素分析和正交实验法对发酵培养进行筛选和优化并对表达产物进行了初步鉴定。 实验器材、实验试剂：
质粒和载体：pGAPZα-A表达载体、E.coli Topl0F′、E.coli DH5α、P.pastoris GSll5、pMD18-T EasyVector
生化试剂：抗生素zeocin、TaqDNA聚合酶、10×Taq buffer、限制性内切酶（Bln I、Xho I和Xba I）、T4连接酶、DNA回收试剂盒。一抗rat anti-human Insulin、二抗goat anti-rat IgG-HRP
培养基：LB培养基，YPD培养基，BMGY培养基，酵母分批发酵培养基，酵母补料生长培养基，酵母诱导培养基，酵母鉴定培养基
器材：分析天平、高压灭菌锅、恒温震荡培养箱、12.8L搅拌发酵罐、分光光度计、精密pH仪、高速冷冻离心机、生化培养箱、超级工作台、电泳仪、尾气分析仪、紫外检测仪、凝胶成像系统、中空纤维切向流系统 实验步骤：
设计引物合成insulin A链与B链:
根据In2sulin氨基酸序列，选用毕赤酵母偏爱密码子，分3段合成Insulin基因：
（1）Insulin基因片段1（Ins1）：5′-tttgtgaaccagcatttgtg tggttctcat ctggtggaag ctttgtacct cgtgtgtggt gag-3′; （2）Insulin基因片段2（Ins2）：5′-ttgctccacgatacc tcttt ggtcttagg agtgtagaaa aaccctctct caccacacac gag-3′; （3）Insulin基因片段3（Ins3）：5′-gttacagtag ttttccagtt ggtagagaga acagatagag gtgcaacatt gctccacgat acc-3′; （4）引物1（P1）：5′-ta ctcgagaaaaga tttgtgaaccagcat ttgt-3′； （5）引物2（P2）：5′-gaggtgcaac attgctccac gatacc-3′； （6）引物3（P3）：5′-gc tctagact attagttacagtagttttcc agt-3′；
PCR连接Ins1和Ins2基因片段利用Ins1和Ins2部分互补及引物P1、P2进行PCR反应，PCR采用25μl反应体系，10×Taq buffer（含200mmol/L Tris-HCl pH8.4；200mmol/L KCl；100mmol/L （NH4）2SO4）15mmol/L MgCl2 2.5μl，特异引物P1、P2和Insulin基因片段Ins1、Ins2（浓度为25μmol/L）各0.5μl，Taq酶1.25U，2.5mmol/L dNTP 2μl，最后加ddH2O将体积调整为25μl。在同一个PCR反应中，采用不同的退火温度，先使Ins1和Ins2退火延伸，再用P1和P2进行扩增，得到Ins1-Ins2片段。PCR程序如下：94℃5min；94℃300s，43℃30s，72℃30s，10个循环；94℃30s，47℃30s，72℃30s，20个循环；72℃，7min；4℃ forever。使用PCR产物回收试剂盒回收PCR产物。
再次PCR：连接Ins1-2和Ins3基因片段利用Ins1-2和Ins3两个片段的互补及引物P1、P3，反应体系同1.2.1.2，采用不同的退火温度扩增得到Insulin全长。PCR程序如下：94℃5min；94℃30s，37℃30s，72℃30s，10个循环；94℃30s，47℃30s，72℃30s，20个循环；72℃7min；4℃ forever。PCR扩增结束后，在2.0%琼脂糖凝胶中进行电泳并回收扩增产物，获Ins1-Ins2-Ins3即Insulin全长基因。PCR产物回收后与克隆载体pMD18-T Vector连接，用热激法转化感受态细胞E.coli DH5α，筛选得到的阳性克隆送测序。
表达载体pGAPZα-A/Insulin的构建：
经测序鉴定后的质粒pMD18-T Vector/Insulin和组成型分泌表达载体pGAPZα-A分别用Xho I和Xba I双酶切，然后将双酶切后的Insulin基因与表达载体pGAPZα
-A用T4 DNA连接酶在16℃连接过夜。产物用CaCl2法转化感受态细胞E.coli Topl0 F′，转化子在含有25μg/ml zeocin的低盐LB平板上初筛，并通过提质粒双酶切鉴定筛选阳性克隆。筛选的阳性克隆送测序。
工程菌GS115/pGAPZα-A/Insulin的构建及筛选：
参照Pichia pastoris Expression Kit手册，表达载体pGAPZα-A/Insulin用Bln I线性化，然后用电转化法转化Pichia pastoris GS115感受态细胞，转化参数为：电压1500V，电容25μf，电击时间10ms。转化子在含有100μg/ml zeocin的YPD平板上初筛，28℃培养2～3d长出单菌落，然后通过菌落PCR筛选阳性克隆。
发酵及表达产物的SDS-PAGE分析： 在转化平板上挑取单菌落于10ml YPD+Zeocin（100μg/ml）培养基中，28～30℃，250r/min振荡培养至OD600为2～6；吸取0.1ml菌液到50ml YPD+zeocin（100μg/ml）培养基中，继续培养5d。收集菌液，4℃，12000r/min，离心10min，取上清；取1.5ml加入5倍体积的丙酮，-20℃放置过夜；4℃，12000r/min，离心10min，弃上清，风干；加入150μl ddH2O溶解后作为SDS-PAGE分析样品。以Tricine-尿素-SDS-PAGE对发酵产物进行分析。
发酵产物的浓缩及Native-PAGE分析：
取10ml发酵液离心，600r/min，5min，去除沉淀下的细胞，取上清，并测量上清液的体积；缓慢加入（NH4）2SO4，使其浓度达到65%（0.43g/ml）；离心，12000r/min，15min，取上清；缓慢加入（NH4）2SO4。使其浓度达到95%（0.71g/ml）；离心，12000r/min，15min，取沉淀；将（NH4）2SO4沉淀后的蛋白利用透析袋进行透析。将透析后的发酵产物进行Native-PAGE分析。
Westernblotting分析：
取GS115、GS115/pGAPZα-A和工程菌的培养上清进行SDS-PAGE（以GAPDH为内参），然后将蛋白从凝胶中经电转移至硝酸纤维素膜上，先用1%的BSA封闭1h，用鼠抗人胰岛素抗体为一抗（抗体稀释比例为1∶300），山羊抗鼠IgG-HRP为二抗（抗体稀释比例为1∶250），显色后曝光以检测重组蛋白的抗原特异性。
菌体培养
摇瓶培养方法
温度30℃，摇床转速230r／min，摇瓶装液量30mL／300mL三角瓶。
单因素实验设计
分别以葡萄糖、甘油作为碳源，对比两者培养效果，利用SPSS软件对实验数据进行分析处理，选取培养效果好的作为碳源；分别以硫酸铵、酵母粉作为氮源，对比两者培养效果，选取效果好的作为氮源。然后对碳源的九个水平（10、15、20、25、30、35、40、45、50g／L）、氮源的九个水平（4、6、8、10、12、14、16、18、20g／L）、0.1mol／L磷酸盐缓冲液的九个水平(10、20、30、40、50、60、70、80、90mUL)、MgS04·71-120的九个水平(8、9、10、11、12、13、14、15、16g／L>、初始pH值的九个水平(5.0、5.3、5.5、5.7、6.0、6.3、6.5、6.7、6.9)等进行单因素分析，用单因素试验筛选出四个因素的三个最佳水平，作为正交试验的因素和水平。
正交试验设计
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