《粮油检验 谷物中黄曲霉毒素B1的快速测
定—免疫层析法》
编制说明
标准起草组 2011年11月
《粮油检验 谷物中黄曲霉毒素B1的快速测定
—免疫层析法》编制说明
一． 制定本标准的必要性及意义
黄曲霉毒素B1（AFB1）是目前已知致癌性和毒性极强的化学物质之一，能致癌、致畸、致诱变。世界上很多国家都对AFB1设定了严格的限量标准。当前国家标准中对黄曲霉毒素B1的检测手段主要有免疫亲和层析净化高效液相色谱法（HPLC法）和酶联免疫吸附法（ELISA法）。但是HPLC法法设备费用昂贵难以普及，ELISA法检测时间长，因此不可能作为粮食现场收购的快速检测。快速检测卡能够在较短的时间完成内对粮食谷物中的黄曲霉毒素B1的检测，可以对粮食谷物中黄曲霉毒素B1是否超标进行初筛。但是检测卡操作步骤、样品提取方法和提取时间、以及方法的准确性等等还不够完善，有必要进一步研究试验、验证，制定规范、简单、高效的快速检测卡测定谷物中黄曲霉毒素B1的行业标准方法。
二． 工作基本情况
按照粮油标准化技术委员会和国家粮食局标准质量中心的要求，由湖北省粮油食品质量监测站、北京国家粮油质检中心、重庆粮油质检中心和广西粮油质检中心参与标准的制订研究工作，湖北省粮油食品质量监测站负责起草本标准。该标准制定任务下达后，成立了标准起草工作小组，制定了工作计划，开展的主要工作如下：
1. 查阅相关文献和与有关真菌毒素检测卡生产企业沟通，了解检测卡运用情况。 2. 2008年6月中旬采集黄曲霉毒素B1的阳性稻谷和玉米样品，用国标方法对样品进行制备和定值。
3.2008年7月18-19日在国家粮食局标准质量中心的组织领导下，湖北省粮油食品质量监测站、北京国家粮油质检中心和2家检测卡厂家在湖北站召开了快速检测卡测定谷物中黄曲霉毒素B1的国家标准制订研讨会及检测方法研究实验，进行了“不同样品提取液的验证实验”、“样品不同粉碎颗粒的验证实验”、“探讨制备样品均一性问题和样品的定值方法”等实验。广泛征求各方意见，完善操作方法。
4.2008年10月17-18日，在湖北站对上海快灵和德国拜发的快速检测卡进一步
进行了验证试验，确定了检测卡操作方法、样品粉碎目数、阳性样品的制备方法和验证试验方案。
5.2009年3月在北京国家粮油质检中心，国家粮食局标准质量中心组织3家省级质监站、南京财经大学、厂家代表及相关专家，召开了“快速检测卡验证实验方法”讨论会，完善并制定了检测卡验证方案和高效液相色谱测定样品黄曲霉毒素B1的具体技术要求。
6.2009年4-9月，3家省级质监站依据验证方案进行了大量的验证试验，并汇总数据形成报告，基本确定了实验操作方法和相关技术要求，9月底形成标准草稿。
7.2009年11月，在湖北省粮油食品质量监测站对标准草稿进行讨论，根据讨论会上有关专家的意见，完善标准内容，补充了试验数据，形成了标准讨论稿。
8.2011年5月对目前国内市场上使用的主要品牌的国产和进口黄曲霉毒素B1快速检测卡进行验证实验。
9.2011年8月，在浙江省粮油质检中心召开了粮油标准基础研究项目快速测定法研讨会，会上对本标准方法文本进行研讨，提出完善方案。
三. 标准编制原则
1. 本标准在制订过程中遵循“科学性、适用性、规范性”的原则，与有关检测卡生产企业联合，在生产企业提供的方法上通过实验，不断完善黄曲霉毒素B1快速检测卡的检测方法，并用国标法规定的高效液相色谱法测定结果作为快速检测卡检测结果确认依据，使方法具有科学性；对易产生黄曲霉毒素B1的主要粮种稻谷、玉米进行方法验证实验，同时对目前国内市场上使用的国产和进口的黄曲霉毒素B1快速检测卡进行验证实验，使方法具有适用性；对检测方法的各个步骤、各项指标结合参考厂家提供的方法及实际运用要求进行改进，使标准方法具有快速和广泛的实用性。
2. 本标准按照GB/T 1.1-2009、GB/T 20000.2-2009 和GB/T 20001.4-2001《标准编写规则 第4 部分 化学分析方法》的规定和要求编写，在标准框架、结构和内容等方面符合这些标准的要求。
3. 强制性国家标准《粮食卫生标准》规定了粮食中黄曲霉毒素B1的安全限量，且本
标准所确定的检测方法能满足该标准的初步筛选测定。
四.标准的主要内容
本标准为推荐性标准，主要结构内容包括： 1.封面 2前言
3标准的主体内容：范围、原理、仪器设备、试剂、操作步骤、结果判断和结果确认。 3.1范围：本标准适用于稻谷、糙米、玉米等谷物的黄曲霉毒素B1是否超过国家标准允许限量值的快速筛选测定。
3.2原理：对目前国内外已有的快速检测卡原理进行分析，其方法原理主要有两种：一是采用非竞争结合的双抗体夹心法的免疫层析检测卡；二是采用竞争结合的胶体金法检测卡。这两种检测卡都是基于特异性抗原抗体反应和免疫层析技术，但是，双抗体夹心法利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子（黄曲霉毒素B1）上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。测试时，样品中黄曲霉毒素B1与固相载体上的抗体结合后再与检测带上的酶标抗体结合而显色，表明为阳性样品；反之，检测色带不显色，结果为阴性。而胶体金法通过特异标记抗体竞争结合固定在硝酸纤膜上的AFB1-BSA（BSA,牛血清白蛋白）完全抗原和样品中被检测抗原分子（黄曲霉毒素B1）。测试时，样品中的黄曲霉毒素B1在渗移过程中与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和硝酸纤维素膜上AFB1-BSA完全抗原的结合，使测试区的检测色带不显颜色，结果为阳性；反之，检测色带显红色，结果为阴性。 3.3提取试剂：乙酸乙酯或甲醇水。
3.4操作步骤：制备有代表性的样品粉碎混匀，加入提取试剂提取，离心，取一定体积的上清液，吹干加入适量的稀释液或直接加入适量的稀释液，点样分析。 3.5结果判断：检测卡中有两种色带，质控色带（control line）和检测色带（test line）。质控色带是用于证明检测条是否正常，显色表示检测卡是正常的。检测色带的有无是用来定性判断样品是阴性还是阳性；或者显色时间的长短来半定量判断样品中黄曲霉毒素的含量多少。
3.5.1免疫层析检测卡的结果判断：
阴性：如果只有质控色带清楚显现，说明样品中不含黄曲霉毒素B1或含量小于对应
的检测限。
阳性：如果质控色带和检测色带都显现，说明样品中含有黄曲霉毒素B1。依据检测
色带显色的时间段不同来确认样品中黄曲霉毒素B1含量大小。比如拜发检测卡，如样品中含有黄曲霉毒素B1含量是20μg/kg则检测色带约 4 分钟后显色，含量是10μg/kg 则检测色带约 8 分钟后显色，含量是4μg/kg则检测色带约 16 分钟后后显色。 3.5.2胶体金检测卡的结果判断：
阳性：质控区显示出红色线条，检测区不显示出红色线条，判为阳性，即样品中黄
曲霉毒素B1含量大于对应的国家标准允许限量。
阴性：质控区显示出红色线条，检测区同时显示出红色线条，判为阴性。即样品中
不含黄曲霉毒素B1或黄曲霉毒素B1含量小于对应的国家标准允许限量。
五. 标准的验证测定实验及结果分析
1．试样制备的验证
本方法为快速检测法，考虑能否对整颗粒样品进行直接检测，尽量达到快速检测的目的。对整颗粒样品、100%过20目筛的样品进行了实验，从表一中可知整颗粒样品检测结果的准确性小于65%，而过20目筛的样品就检测结果的准确性大于90%。因此本标准方法要求待测样品必须粉碎，粉碎后100%过20目筛。
表一：整颗粒样品的检测结果
样品 编号 1 2 3 4 整颗粒糙米 5 6 7 8 9 检测卡判定结果 阴性,<10μg/kg 阴性,<10 μg/kg 阳性, >10μg/kg 阴性,<10μg/kg 阴性,<10 μg/kg 阳性, >10μg/kg 阴性,<10 μg/kg 阴性,<10 μg/kg 阴性,<10μg/kg 阴性,<10 μg/kg 阴性,<10 μg/kg 阳性, >10μg/kg 阴性,<10 μg/kg 阴性,<10 μg/kg 阳性, >10μg/kg 阴性,<10 μg/kg 阴性,<10 μg/kg 阴性,<10 μg/kg 真实值/（μg/kg） 0.85 5.1 8.4 19.8 0.85 25.4 0.85 4.1 13.1
粮油检验谷物中黄曲霉毒素B1的快速测定—免疫层析法编制说明
