Tfh细胞及其转录因子Ascl2在慢性乙型肝炎感染中的作用

Tfh细胞及其转录因子Ascl2在慢性乙型肝炎感染中的作

用

王亚宁 范超 申焕君 郝春秋 贾战生

【摘 要】【摘要】 目的 探讨滤泡辅助性T淋巴细胞(follicular helper T lymphocyte，Tfh)细胞及其转录因子无刚毛鳞甲复合体样蛋白2(achaete-scute homologue 2，Ascl2)在慢性HBV感染中的表达和意义。方法 选择CHB患者40例，健康对照者30名。采用流式细胞术检测CD4+CXCR5+ Tfh细胞及CD4+CXCR5+PD-1+ Tfh细胞频数；实时定量 PCR 法检测Tfh细胞中 Ascl2表达水平；ELISA检测血清中各细胞因子水平。结果 与健康对照者相比：CHB患者的CD4+CXCR5+ Tfh及CD4+CXCR5+PD-1+ Tfh细胞频数升高，差异有统计学意义(t=4.786,P<0.05)；CHB患者中Ascl2 mRNA表达升高,差异有统计学意义 (t=4.655,P<0.05)；CHB患者的IL-21、IL-17均升高，差异均有统计学意义(t=4.896和 t=3.764，P<0.05)。结论 Ascl2可能与HBV感染者Tfh细胞的分化发育有关。 【期刊名称】肝脏

【年(卷),期】2018(023)012 【总页数】4

【关键词】【关键词】 滤泡辅助性T淋巴细胞；慢性乙型肝炎；无刚毛鳞甲复合体样蛋白2 【

文

献

来

源

】

https://www.zhangqiaokeyan.com/academic-journal-cn_chinese-

hepatology_thesis/0201272926460.html

·论 著·

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81471541)

在HBV感染过程中，病毒可干扰机体产生特异性的CD4+T细胞免疫，从而引起体液免疫失衡。在效应B细胞介导的体液免疫应答中，滤泡辅助性T淋巴细胞(Tfh)起着至关重要的作用,Tfh细胞功能异常可能是引起慢性乙型肝炎(CHB)患者B细胞分化紊乱的主要原因[1]。CHB的发生和转归都与机体的免疫力有一定的关联。机体免疫参与HBV感染过程,对机体抗病毒有重要作用，Tfh细胞具有增进有效抗体产生的功能[2-3]。Tfh对病毒抗原的加工和有效提呈是机体清除病毒的重要方面，其在慢性HBV感染者的作用机制尚不清楚。本研究运用实时定量 PCR技术、流式细胞术和酶联免疫吸附方法检测转录因子Ascl2、CD4+CXCR+PD-1+ Tfh细胞以及细胞因子IL-17、IL-21在CHB中表达，为阐明其在CHB发病中的作用提供依据。

资料和方法

一、一般资料

选取2015年9月至2016年3月唐都医院感染科就诊的CHB患者40例，平均年龄为(44.4±7.9)岁。入选的病例经确诊并排除其他病毒感染(HIV、HCV等)及自身免疫性疾病。同时，取30名平均年龄为(40.6±6.9)岁健康体检者为对照组。两组间年龄、性别分布差异无统计学意义(均P>0.05)。所有的病例采集均签订知情同意书，并且得到医院伦理委员会的批准。 二、方法

(一)全血样本的处理 将血液标本1500 r/min离心10 min(离心半径为15 cm)，离心结束后吸出上层血浆，分装标记后置于-80 ℃冰箱储存备用。在淋巴细胞分离液的上层将1640混合液缓慢加入；2320 r/min离心20 min(离心半径为

20 cm)，吸取淋巴细胞液层，加入1640溶液清洗，1500 r/min 离心10 min，分离出外周血单个核细胞(PBMC)，并计数，于-80 ℃的冰箱中待检。

(二)流式检测相关因子 将冻存的 PBMC复苏、洗涤，用含10%胎牛血清、90% RPMI 1640培养基培养，置于37℃、体积分数为0.05的CO2条件下培养30 min，将每个样本细胞分装于4个流式管中，2管为染色管，2管为同型对照管，离心，弃上清，染色管每管加入100 μL PBS，加入小鼠抗人 PerCP-cy5.5-CXCR5mAb，APC-CD4mAb、PE-CD279 mAb (PD-1)；对照管分别加入各色的同型对照mAb，加入小鼠抗人PerCP-cy5.5 IgG1κ ISO，小鼠抗人PE IgG1κ ISO，小鼠抗人APC IgG1κ ISO;将以上处理过的样本4 ℃避光孵育30 min。孵育后每管加入2 mL PBS，300×g离心10 min，弃上清，再次用PBS洗涤，加500 μL PBS重悬细胞；300目滤网过滤以上重悬细胞；使用BD FACS Aria流式细胞仪检测染色细胞，FlowJo7. 6 软件分析结果。

(三) Tfh细胞免疫磁珠法分选 冻存的PBMC细胞运用免疫磁珠法分选Tfh细胞，实验操作严格按照说明书进行。

(四) RNA提取 将分选的Tfh细胞标本迅速标记后放入液氮中保存。用TRIzol试剂(Takara公司)提取总RNA，-80 ℃冰箱保存备用。

(五) 实时定量PCR检测Ascl2 mRNA的表达 Ascl2和β-actin基因的 PCR 引物参照文献设计[4]，由上海生物工程有限公司合成，见表 1。Ascl2反应条件为：42 ℃，2 min；37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。最后采用实时定量PCR检测Ascl2 mRNA的表达，反应条件为 ：95 ℃，2 min；95℃，5 s；60℃，20 s；40个循环；最后从 65 ℃ 缓慢升温到 95 ℃(每2秒升高 0.5 ℃)。 (六)外周血IL-21、IL-17的检测 采用双抗体夹心ELISA，检测仪器为DENLEY