DEC 2012
植物病毒载体的类型及应用
摘要：植物病毒载体可分为5种类型，烟草花叶病毒载体是最常用植物病毒载体。植物病毒载体应用广泛，有诸多优点，也存在一些问题。本文对植物病毒载体进行综述。 关键词：植物病毒载体；类型；烟草花叶病毒载体；应用 The Types and Application of Plant Virus Vectors Abstract: Plant virus vectors can be divided into five types. Tobacco Mosaic Virus vector is the most commonly used plant virus vector. Plant viral vectors are widely used. They have many advantages，as well as some problems. This article provides an overview of plant virus vectors. Key words: plant virus vectors; type; Tobacco Mosaic Virus vector; application DNA 体外重组是基因工程技术的重要步骤之一，它是将外源目的基因与适当的载体相连。要把一个目的基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具，这个携带目的基因进入受体细胞中的工具就称为载体(Vector)。载体有很多种，病毒载体是其中的一种。病毒载体是利用病毒的基因组序列元件构建的真核基因转录工具。植物病毒载体的研究开展得较晚，1984 年才诞生了第一例由植物DNA病毒——花椰菜花叶病毒(Califlower mosic virus，CaMV)构建的载体。但是植物病毒载体具有很多优点，例如短时间内可以生产大量成本低廉的外源蛋白，满足医药及工业用蛋白的需求。因此，1984年之后，人们尝试了多种植物病毒载体构建方法。目前已经构建了多种类型的植物病毒载体，已有用植物病毒载体pClYVV 表达了绿色荧光蛋白基因、 Nodulin gene基因、人的α-干扰素基因及小球状病毒抗原蛋白基因等的报告[3]。近年来也逐步利用植物病毒载体作为探针，用于研究植物和植物 [2][1]病原基因的表达调控、编码产物的功能以及植物与病原的相互作用。 一 植物病毒载体的类型 植物病毒载体可分为置换型载体、插入型载体、互补型载体、抗原展示型载体和融合/释放型载体5 种。 1 置换型载体 置换型载体是最原始的载体类型，由外源基因置换对植物病毒基因组复制影响不大的基因构建而成，一般用于转染原生质体进行瞬时表达以验证构建载体的可行性，较少接种于植株来系统地表达外源基因。CaMV 首先被用于构建置换型载体的研究。用外源基因置换CaMV 的基因Ⅱ(蚜传因子)后不影响其侵染性，成功地表达了细菌二氢叶酸还原酶(DHFR)和人α-D 干扰素基因[4]，IFN-αD 的表达量可达到2μg/g(鲜叶)。
2 插入型载体 插入型载体是在病毒基因组中引入额外的亚基因组启动子，将外源基因插入此启动子下游，随病毒的增殖使外源基因得以大量表达。 构建插入型载体至少要考虑外源基因的插入位置、外源基因的大小和外源基因的启动子3个因素。外源基因的插入不能影响病毒正常基因的表达，外源基因不能过大，否则可能会影响病毒外壳的组装和运动而使外源基因不能表达。对于球状或二十面立体等轴对称病毒来说，包装限制决定了插入的外源编码序列不能太大。丝状或杆状植物病毒，如CaMV、马铃薯Y 病毒(Potato virus Y，PVY)和豇豆花叶杆状DNA 病毒(Cowpea mosaic virus，CPMV)等植物病毒因为不存在包装限制，适于构建插入型载体[5]。通常用病毒的CP（衣壳蛋白）或复制酶亚基因组启动子，为了避免同源重组，需采用亲缘关系较远病毒的亚基因组启动子。目前主要有马铃薯X病毒(Potato virus X，PYX)[6]、烟草花叶病毒、豇豆花叶病毒和番茄丛矮病毒(Tomato bushystunt virus，TBSV)这4种植物病毒用于构建插入型载体，其中PYX 载体多用做探针，研究植物和植物病毒基因结构与功能，以及病毒与宿主之间的相互作用。烟草花叶病毒和豇豆花叶病毒载体主要用于展示医药用的外源小肽。 3 互补型载体 为了弥补置换型载体和插入型载体的不足，研究人员设计了互补型载体。互补型载体是将外源基因插入缺陷型病毒或亚病毒粒子中，通过转基因植物或与辅助病毒共侵染而互补缺陷。利用转基因植物表达病毒基因是由转基因植株提供失活基因产物，弥补缺陷型病毒载体失去的功能。亚病毒互补载体系统利用亚病毒表达外源基因，与辅助病毒共接种，由辅助病毒提供失活基因产物。构建亚病毒互补载体系统是一个很有希望的方向，但需要进一步研究外源基因插入的位点、载体的稳定性及对寄主植物症状和病毒运动的影响。 4 抗原展示型载体 抗原展示是将外源基因选择性地插入病毒CP 基因中融合表达，而正好使外源多肽呈现在病毒粒子表面，通过提纯重组病毒即可获得大量的抗原[7]。这种方法避免了双亚基因组启动子可能的同源重组，增强了外源多肽的抗原性，因而适用于抗原性较差、难以用其他方法表达和纯化的小肽。但构建抗原展示型载体需要在原子水平了解病毒的结构，因而仅用于结构较为清楚的几种病毒，应用较多的是TMV、CPMV 和TBSV。 5 融合/释放型载体 这是新近发展的病毒载体类型。它建立在插入型载体的基础之上，为了避免双亚基因组启动子可能带来的不稳定性和融合表达可能影响病毒的系统侵染，在插入外源基因的同时在病毒基因组中引入病毒自身蛋白酶的切割加工位点或口蹄疫病毒(FMDV)2A蛋白酶序列，使外源基因与CP的融合表达产物能被蛋白酶切割而释放。Santa等构建了PVY 的融合/释放载体，研究表明该载体不仅能系统侵染和表达游离的绿色荧光蛋白(GFP)和CP(能提供系统侵染功能)，也产生大量的GFP-CP 融合蛋白，并组装成病毒粒子，子代病毒粒子的浓度约为野生型PVY 的2 倍。 二 烟草花叶病毒载体 烟草花叶病毒(TMV)是目前研究最为广泛的一类植物病毒，病毒粒子为短杆状，能在被侵染的植物细胞中大量积累，具有作为表达载体的潜力[8]。迄今，TMV 载体成功表达的外源基因至少已有150 种。 1 TMV的基因组结构 TMV是单链RNA 病毒，基因组长6395个核苷酸，包括4个编码区，至少编码4种多肽，分别是126ku、183ku、30ku 和17.5ku 蛋白[9]。其中126ku 和183ku两种病毒蛋白参与病毒的复制，而30ku 蛋白质则与病毒从一个细胞转移
到另一个细胞的运动有关，又称移动蛋白(MP)，17.5ku 蛋白为病毒的外壳蛋白(CP)。由此可见，这3 种蛋白质是TMV在被感染的植株中传播繁殖的基本条件。鉴于外壳蛋白质能够大量地合成，同时又是病毒繁殖的非必要成分，即使外源基因插入导致外壳蛋白突变失活，对病毒的繁殖也是无关紧要的。因此，该基因被认为是导入和表达外源基因的理想位点[10]。 2 TMV克隆载体的构建 N. Takamatsu 等在1987 年发展出一种经过修饰改造的、可以在体外转录出具感染性的TMV-RNA 的全长TMV-cDNA 克隆。把细菌氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因，插入在该克隆中紧挨外壳蛋白基因起始密码子的下游，构成了TMV-cDNA-CAT重组体。然后把此重组体体外转录形成的转录物接种烟草植株，结果在被接种的烟草叶片中观察到了CAT 活性。 由于TMV不存在包装限制，Dawson 等于1989 年构建了一个可复制的附加载体来弥补TMV替换载体的不足，在这个附加载体中保留了完整的野生型基因组[11]。Dawson 及其同事在TMV 基因组的运动蛋白基因和外壳蛋白基因之间加上了一个细菌cat 基因，这个cat 基因受双倍的外壳蛋白亚基因组启动子调控。在这种情况下，系统性感染伴随着高水平CAT 活性而发生，但是在感染植物中发生的重组会使外源转入基因产生缺失并产生野生型的TMVRNA。用齿瓣兰环斑病毒上的等价基因替换TMV 外壳蛋白基因可以防止同源重组的发生。这种方法已用来产生一系列非常稳定的表达载体，这些载体可用于在植物中合成许多有价值的蛋白。 三 植物病毒表达载体的应用 1 基础研究领域的应用 植物病毒载体的出现为许多基础生物学研究提供了强有力工具，包括基因重组，植物病毒的运动，包壳和传播，鉴定和分析基因的功能以及基因沉默等。 2 商业应用 植物病毒载体最有价值的应用是生产医用蛋 白或疫苗[12]，因而备受重视。迄今为止，利用植物病毒载体至少已有20 多种医用蛋白或疫苗抗原获得成功表达。例如，在大肠杆菌中表达α天花粉蛋白时，表达量仅占细菌总蛋白的0.01%，而用TMV 做载体，表达量高达可溶性蛋白的2%，而且构建的载体还可以系统侵染烟草植株。由于α天花粉蛋白在治疗人免疫缺陷病毒(HIV)病中具有很好的疗效，因此大量生产α天花粉蛋白不仅可望用于临床治疗，还可以用于研究HIV 的分子致病机理。 四 植物病毒载体表达外源基因的优点 ①部分植物病毒对寄主的感染是系统性的，它能够将其基因组扩散到被感染植株的所有细胞。因此，如果在病毒的基因组上插入外源基因，那么它也就会系统地分布到整个植株，无须经过从原生质体到再生植株的繁琐程序。病毒的这种感染方式，为简化植物基因工程中外源基因的传递过程提供了极大的可能性。 ②植物病毒载体有可能解决将外源基因导入像玉米这样的单子叶植物的问题。Ti质粒载体只能有效地转化双子叶植物，但对诸如小麦、水稻这样的单子叶植物，依然有不少困难。而像双生病毒(geminivirus)由于具有广泛的寄主范围，有可能被发展成单子叶植物基因克隆载体。 ③被感染的植株能够繁殖出大量的病毒颗粒，因此有可能通过重组病毒载体利用植物来生产大量的外源蛋白质[13]。这也就是说，可以不必使用高成本、高投入的酵母或细菌发酵罐，就可以直接在大田种植，获取大量廉价的药用蛋白及具有重要经济意义的商品蛋白质。 五 植物病毒载体存在的问题 1 稳定性 植物病毒载体的致命缺点是稳定性较差，常由于病毒基因的重组而导致丢失外源基因[14]。这可能是由于插入型载体的双亚基因组启动子的同源重组造成的。
植物病毒载体
