Streptomyces alboflavus 抗真菌物质对串珠镰刀菌的抑制机理研究 

Streptomyces alboflavus抗真菌物质对串珠镰刀菌的抑

制机理研究

王志芳1,2, 李贞景2, 杨明冠2, 路来风2， 王昌禄2，*, 李 政3,张健飞3, 巩继贤3

【摘 要】 研究了Streptomyces alboflavus产生的抗真菌物质对串珠镰刀菌的抑菌机理。通过pH纸层析和捷克八溶剂纸层析实验对抗菌物质进行定性分析；利用荧光显微镜和扫描电子显微镜观察抗菌物质对串珠镰刀菌细胞膜和细胞壁的破坏作用；通过细胞膜和细胞壁主要组分对抑菌物质的拮抗效果，探索抑菌物质的作用靶点；用高效液相色谱法检测抑菌物质对串珠镰刀菌细胞膜中麦角甾醇的抑制作用。极性实验显示，该物质呈中性，捷克八溶剂纸层析表明，该物质属于非水溶性Ⅰ型抗生素；光学显微镜观察，抑菌物质对串珠镰刀菌孢子萌发有抑制作用，同时使菌丝畸形，顶端、中部出现膨大泡囊，呈“念珠状”；经PI染色后荧光显微镜观察，抗菌物质作用后的菌丝细胞膜通透性改变，进一步通过扫描电子显微镜观察，发现泡囊状菌丝表面凹凸不平，并残留有碎片；抑菌物质对细胞壁和细胞膜的组分拮抗作用和高效液相色谱方法检测显示，抑菌物质影响细胞膜中麦角甾醇的合成。研究结果表明，Streptomyces alboflavus产生的抗真菌物质发挥抑菌作用时，影响串珠镰刀菌细胞膜中麦角甾醇的合成。本研究可为抑菌物质的鉴定和拮抗菌的应用提供理论参考。 【期刊名称】《食品科学技术学报》 【年(卷),期】2019(037)005 【总页数】8

【关键词】 白黄链霉菌； 串珠镰刀菌； 抑菌物质； 抑菌活性； 抑菌机理

引用格式：王志芳，李贞景，杨明冠，等.Streptomyces alboflavus抗真菌物质对串珠镰刀菌的抑制机理研究[J]. 食品科学技术学报，2019,37(5):64-71. WANG Zhifang, LI Zhenjing, YANG Mingguan, et al. Inhibition mechanism of Streptomyces alboflavus antifungal substance against Fusarium moniliforme[J]. Journal of Food Science and Technology, 2019,37(5):64-71.

基金项目： 天津市科技计划重点项目(16YFZCNC00700)；国家自然科学基金资助项目(31701668)；天津市自然科学基金资助项目(17JCQNJC14300)。 镰刀菌是世界性分布的一类真菌，可侵染达100余种植物，引起植物的根腐、茎腐、花腐和穗腐等多种病害[1-2]。镰刀菌侵染寄主植物维管束系统，破坏植物的输导组织维管束，并产生毒素，造成作物萎蔫死亡，属于生产上最难防治的重要病害之一。镰刀菌在世界范围内造成许多毁灭性的植物病害，如串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)造成香蕉萎蔫病，禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)造成颈腐病等[3-5]。串珠镰刀菌还会污染玉米、高粱、小麦、棉花及某些饲料等，为非专性、非宿主特异性病原菌，其水溶性代谢产物伏马菌素(fumonisin)，还可以引起动物各种疾病，如马脑白质软化症、猪肺水肿或大鼠肝癌[6-7]。采用生物防治手段对有害霉菌及其毒素进行防控，对环境污染小，符合农业可持续发展战略方向，受到国内外科学家关注。

链霉菌是重要的生防菌株，利用链霉菌产生的次级代谢物开发抑菌剂具有天然、安全、抑菌效果好等特点，被广泛用于农业及医药领域[8-10]。随着现代生物技术的发展，研究者们在极端环境微生物、新菌种筛选、新物质分离等方面取

得了一定的成果。链霉菌具有产生多种次级代谢物的能力，对寻找具有新颖化学结构及开发新作用机理的抗菌药物生物活性资源具有重要意义[11-14]。 Streptomyces alboflavus是从土壤中筛选到的一株拮抗菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC No. 4666)，16S rDNA在NCBI注册登录号为JX915780，鉴定为白黄链霉菌。对峙培养法研究发现，该菌对黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、纯绿青霉(Penicillium verrucosum)、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄腐镰刀菌(Fusarium solani)等常见重要植物病原菌具有广谱拮抗作用，尤其对串珠镰刀菌的抑制效果最好，且还会产生挥发性抑菌物质[15-16]。为进一步研究Streptomyces alboflavus产生的生物活性物质，本研究对其产生的胞内抗菌物质进行定性分析，并研究其活性物质对串珠镰刀菌的抑菌机理，希望为利用链霉菌开展镰刀菌的生物防治技术研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料 1.1.1 菌株和培养基

拮抗菌株：拮抗链霉菌菌株Streptomyces alboflavus，本实验室自天津市宝坻区饲料厂储粮仓周围的土壤中筛选分离获得并保藏。供试菌株：串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)，由天津市畜牧兽医研究所提供。

供试培养基：高氏一号液体培养基，用于Streptomyces alboflavus发酵液的培养；PDA培养基，用于指示菌串珠镰刀菌的培养及拮抗活性的测定。 1)高氏一号合成培养基配方：可溶性淀粉，20.0 g；NaCl，0.5 g；

FeSO4·7H2O，0.01 g；MgSO4·7H2O，0.5 g；KNO3，1 g；K2HPO4，0.5 g；琼脂，20 g；自来水，1 000 mL；调节pH值7.2～7.4。

2)高氏一号液体培养基配方：可溶性淀粉，20.0 g；黄豆粉，10.0 g；KNO3，1.0 g；K2HPO4，0.5 g；NaCl，0.5 g； MgSO4·7H2O，0.5 g；FeSO4·7H2O，0.01 g；自来水，1 000.0 mL；pH值7.2～7.4。

3)PDA培养基配方：称取去皮马铃薯200.0 g，切成小块，加入1 000.0 mL水，煮沸30 min，用双层纱布滤成清液。加水至1 000.0 mL，然后加入20.0 g葡萄糖至完全溶解，pH值自然。

4)查氏培养基配方：NaNO3，3.0 g； K2HPO4，1.0 g；MgSO4·7H2O，0.5 g；KCl，0.5 g；FeSO4·7H2O，0.01 g；蔗糖，30.0 g；蒸馏水，1 000 mL；pH值自然。 1.1.2 原料和试剂

黄豆粉，食品级，天津市售黄豆粉；硫酸亚铁、硫酸镁，化学纯，天津市化学试剂一厂；可溶性淀粉、氯化钠、硝酸钾，分析纯，天津市北方天医化学试剂厂；胆固醇(质量比94%)、麦角甾醇(质量比大于75%)，Sigma-aldrich公司；葡聚糖(质量比大于97%)，百特纯大分子科技有限公司；壳聚糖(质量比大于85%)，湖北圣天宇公司；硅胶G、硅胶H，青岛海洋化工厂；葡聚糖凝胶LH- 20，Pharmacia公司。 1.2 仪器和设备

LS- B50L型立式压力蒸汽灭菌锅，上海华线医用核子仪器有限公司；KCL2000型恒温恒湿培养箱，日本Eyela东京理化公司；AG22331型高速离心机，德国Eppendorf公司； CX41型生物显微镜、BX- 60型荧光显微镜，Olympus公

司；SU- 1510型扫描电子显微镜，Hiachi公司。 1.3 实验方法

1.3.1 Streptomyces alboflavus的发酵培养

将Streptomyces alboflavus菌株划线于高氏一号固体培养基斜面上进行活化， 28 ℃恒温培养箱中培养5～6 d，制备1×106 CFU/mL孢子悬液，按体积分数10%添加量加入到液体发酵培养基中，28 ℃，180 r/min摇床培养6 d。 1.3.2 Streptomyces alboflavus中抑菌活性物质的分离纯化

用8层纱布过滤发酵液，得到链霉菌菌丝体。甲醇浸提菌丝体，将浸提液减压浓缩，粗提物经萃取、硅胶吸附柱层析、葡聚糖凝胶LH- 20柱层析分离纯化，得到脂溶性抑菌组分。 1.3.3 抑菌活性物质检测方法

采用牛津杯法测定抑菌物质的生物活性。将串珠镰刀菌的孢子悬浮液接种于PDA培养基中，然后放置3个牛津杯，将活性物质加入一个牛津杯，其余两个作为空白对照组，培养3 d。 1.3.4 抑菌活性物质pH纸层析

以新华一号层析纸为固定相，用pH值为2.2～8.0的磷酸氢二钠- 柠檬酸缓冲液及pH值9～10的甘氨酸- 氢氧化钠溶液分别处理各滤纸条，晾干后备用。在每个pH值的滤纸条上一端标记起点，取抑菌物质20 μL进行点样，晾干后分别在水饱和的正丁醇、水饱和的乙酸乙酯、体积分数50%的乙醇中展层，用生物学显迹法测迁移率Rf值，具体方法见参考文献[17]。 1.3.5 抑菌活性物质Doskochilova溶剂纸层析

溶剂系统：Ⅰ.水饱和的正丁醇；Ⅱ.水饱和的正丁醇，内含质量比2%的对甲苯