___________小鼠TLR3基因双敲除打靶载体构建及巨噬细胞RAW264.7^TLR3-/-细胞系的建立___________

南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2018，49（5）：993-9995期2095-1191；ISSNCODENNNXAABhttp://www.nfnyxb.com·993·DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2018.05.24小鼠TLR3基因双敲除打靶载体构建及巨噬细胞

RAW264.7TLR3-/-细胞系的建立

2，32

韦显凯1，，覃晴1，，祝

2222*2*

健1，，唐海波1，，梁晶晶1，，李晓宁1，，罗廷荣1，

（1亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南宁

3

530004；2广西大学动物科学技术学院，南宁

530001）

530004；

广西动物疫病预防控制中心，南宁

摘要：【目的】建立Toll样受体3（TLR3）基因缺失的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系，为探索狂犬病毒感染机体过程中TLR3在固有免疫反应中的作用机制提供理论依据。【方法】采用GoldenGateKit试剂盒组装转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）打靶载体pTALEN-TLR3，经酶切和测序验证其连接正确后，通过脂质体瞬时转染RAW264.7细胞，转染后提取细胞DNA，用T7核酸内切酶酶切验证TALEN质粒剪切活性。【结果】TALENs左右臂分两部分连接，首先完成A、B部分的各自连接，然后分别将T1LA与T1LB、T1RA与T1RB、T2LA与T2LB、T2RA与T2RB连接，TALEN模块经过两次连接后的PCR鉴定结果显示，T1L、T1R和T2L的4个克隆均呈阳性，T2R有3个克隆呈阳性。T2L和T2R质粒共转染RAW264.7细胞后提取DNA为模板，经PCR扩增后用T7核酸内切酶进行酶切，酶切后的DNA电泳结果显示TALEN2剪切活性较强，共获得3条条带（931、555和376bp）。TALEN打靶载体pTALEN-TLR3转染RAW264.7细胞24h后用胰酶进行消化，并加入800μg/mLG418进行筛选，7d后获得细胞单克隆；挑选阳性细胞克隆进行T7核酸内切酶酶切鉴定及测序，结果发现4-1和4-40号细胞克隆为双敲细胞系，均缺失7bp的核苷酸碱基，为非3整数倍碱基缺失，可造成后续基因移码突变，使细胞基因功能失活。【结论】通过TALEN技术可成功构建TLR3基因双敲除的小鼠巨噬细胞RAW264.7TLR3-/-细胞系，且可用于狂犬病毒感染细胞后细胞因子和TLR3间的关系研究。

关键词：狂犬病毒；RAW264.7细胞；转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）；Toll样受体3（TLR3）；基因敲除中图分类号：S852.33

文献标志码：A

文章编号：2095-1191（2018）05-0993-07

ConstructionoftargetedvectorofmouseTLR3genedouble

knockoutandmacrophageRAW264.7TLR3-/-cellline

2，32222

WEIXian-kai1，，QINQing1，，ZHUJian1，，TANGHai-bo1，，LIANGJing-jing1，，

2*2*

LIXiao-ning1，，LUOTing-rong1，

（1StateKeyLaboratoryforConservationandUtilizationofSubtropicalAgro-bioresourses，Nanning530004，

2

China；CollegeofAnimalSciencesandVeterinaryMedicine，GuangxiUniversity，Nanning530004，China；

3

GuangxiCenterforAnimalDiseaseControlandPrevention，Nanning530001，China）Abstract：【Objective】TheaimsofthisexperimentwasthroughestablishingmacrophageRAW264.7celllinelacked

Toll-likereceptors3（TLR3）genetoprovidetheoreticalbasisforexploringtheroleofTLR3ininherentimmunityduringtheprocessofrabiesvirusinfection.【Method】TheGoldenGateKitwasusedforconstructingtranscriptionactivationeffectfactornuclease（TALEN）targetingvectorpTALEN-TLR3，andcorrectnesswasverifiedbyenzymedigestionandse-quencing，RAW264.7cellsbyweretransientlytransfectedliposome，andthecellsDNAwasextractedaftertransfection，thentheshearactivityofpTALEN-TLR3wasverifiedwithT7nucleicacidenzyme.【Result】TheconnectionofleftarmandrightarmofTALENswasconstructedbytwosteps.Inthefirststep，partAandBwereconnectedseparately.ThenT1LAandT1LB，T1RAandT1RB，T2LAandT2LB，T2RAandT2RBwereconnectedseparately.Afterthetwosteps，TALENmodulewasidentifiedbyPCR，theresultsshowthatallthefourclonesofT1L，T1RandT2Lwerepositive，threeclonesofT2Rwerepositive.TheT2LandT2Rplasmidswereco-transfectedtoRAW264.7cells，andthenDNAwasextractedastemplate，whichwasimplementedinenzymedigestionbyT7nucleicacidendonucleaseafterPCRamplifica-收稿日期：2018-03-09基金项目：国家自然科学基金项目（31570147）作者简介：*为通讯作者：李晓宁（1981-），博士，主要从事动物病毒学研究工作，E-mail：854915518@qq.com；罗廷荣（1962-），博

士，教授，博士生导师，主要从事动物病毒学研究工作，E-mail：tingrongluo@gxu.edu.cn。韦显凯（1982-），高级兽医师，主要从事动物传染病防控研究工作，E-mail：505439925@qq.com

·994·南方农业学报49卷tion.TheDNAelectrophoresisresultsafterenzymedigestionshowedthatTALEN2shearactivitywasstrong，andthree

bands（931，555and376bp）wereobtained.RAW264.7cellsweretransfectedwiththeTALEN2-TLR3，andthendigestedwithpancreaticenzymesafter24h，andwerescreenedbyadding800μg/mLG418，asingleclonewasobtainedafter7d.ThepositivecellcloneswerechosenforidentificationandsequencingbyT7endonucleasedigestion.TheresultsshowedthatNo.4-1and4-40clonecellsweredoubleknockoutcelllines，theyallmissed7bpnucleotidebases，asnon-threeinte-gertimesbasedeletion.Itcouldcausesubsequentframeshiftmutations，andinactivatedgenefunctionofthecell.【Con-clusion】RAW264.7TLR3-/-celllinefrommacrophagesofmicewiththedoubleknockoutofTLR3genewasconstructedsuccessfullybyTALENtechnology.ThiscanbeappliedforfurtherstudyontherelationshipbetweencytokinesandTLR3afterrabiesvirusinfectscells.

Keywords：rabiesvirus；RAW264.7cell；transcriptionactivationeffectfactornuclease（TALEN）；Toll-likecep-tors3（TLR3）；geneknockout

0引言

【研究意义】Toll样受体3（Toll-likereceptors3，TLR3）位于细胞内膜上，是机体识别外源病原体的重要受体，通过特异性识别双链RNA（dsRNA）而激活细胞内信号转导通路并活化特定的细胞因子，最终诱导产生干扰素（IFN）（Beutler，2003）。狂犬病毒感染动物机体或细胞后能通过TLR3刺激宿主产生I型干扰素（Chopyetal.，2011；王攀等，2017），而I型干扰素通过与细胞膜上的特异受体结合，引发级联性的信号并传递到细胞核内，对一系列干扰素刺激基因的表达进行调控，诱导靶细胞产生特异性抗病毒蛋白（李军和曾芸，2006）。因此，通过敲除小鼠巨噬细胞RAW264.7的TLR3，对研究狂犬病毒感染RAW264.7细胞后的细胞因子产生通路具有重要意义。【前人研究进展】转录激活样效应因子（Transcrip-tionactivator-likeeffector，TALEs）是一种能与DNA结合的天然蛋白，最初在植物黄单胞菌中发现，可通过Ⅲ型分泌系统进入宿主细胞，也被称为Ⅲ型效应物（Jiangetal.，2013）。TALEs通过其独特结构能与DNA特异性结合（MoscouandBogdanove，2009），结合部位是由7~34个高度同源的重复单元组成，尤其是重复单元的第12和13位氨基酸对DNA的特异性识别起重要作用（Maketal.，2013）。重复单元由N端开始到C端结束，其排列顺序与识别的DNA双链5'端到3'端的碱基顺序一致，一个重复单元的双氨基酸残基（Repeatvariantdiresidue，RVD）特异识别一个碱基对（曲晓辰等，2016）。TALEs可特异性识别任意设计的DNA序列，配合核酸酶、转录因子或同源重组序列，实现生物体内的基因靶向操作，包括基因敲除、同源重组和基因激活等，同时可调节目的基因转录（Geissleretal.，2011；Milleretal.，2011；San-janaetal.，2012）及对基因组进行编辑（BogdanoveandVoytas，2011；Tessonetal.，2011）。因此，TALEN技术是一种新型的基因敲除方法（Christianetal.，

2010）。此外，识别特异DNA序列的TALE与核酸内

切酶FokI偶联，构建获得剪切特异DNA序列的内切酶转录激活样效应因子核酸酶（TALEN），将其转入细胞中可实现靶基因敲除（Mussolinoetal.，2011）或DNA定点修饰（Christianetal.，2010；Mahfouzetal.，2011；Morbitzeretal.，2011）。Toll样受体（TLR）是固有免疫中高度保守病原体相关分子模式（Patho-gen-associatedmolecularpattern，PAMPs）的特异性模式识别受体，通过识别微生物的保守序列而在炎症反应及机体固有防御体系中发挥重要作用。其中，TLR3可识别dsRNA及病毒复制过程中产生的中间复合物，活化IFN-α/β而限制感染部位病毒的复制，形成局部抗病毒状态（Krishnanetal.，2007）。Chen等（2016）研究发现，猪圆环病毒2型（PCV2）感染能显著上调体外培养猪肺泡巨噬细胞中TLR3的表达；王鹏飞等（2016）研究表明，抗蓝耳病猪肺组织中的TLR3基因表达量显著高于易感蓝耳病猪，即TLR3基因高表达可能与猪对蓝耳病的抗性有关；姜雪婷等（2017）研究表明，PCV2感染猪后第7和14d，TLR3mRNA与蛋白表达显著上调。【本研究切入点】小鼠巨噬细胞RAW264.7是由鼠白血病病毒诱导后得到的细胞株，具有很强的黏附和吞噬抗原能力，是动物体内重要的免疫应答细胞之一，在适应性免疫和固有免疫中发挥重要作用（Beutler，2003）。因此，RAW264.7细胞适用于狂犬病毒感染后产生的固有免疫相关细胞因子研究。【拟解决的关键问题】以小鼠巨噬细胞RAW264.7为模型，建立TLR3基因双敲除细胞系，并通过TALEN打靶载体的构建及验证，瞬时转染RAW264.7细胞后用于TLR3-/-细胞系筛选，为探索狂犬病毒感染机体过程中TLR3在固有免疫反应中的作用机制提供理论依据。

1材料与方法

1.1

试验材料

RAW264.7细胞由广西大学亚热带农业生物资

5期韦显凯等：小鼠TLR3基因双敲除打靶载体构建及巨噬细胞RAW264.7TLR3-/-细胞系的建立

·995·源保护与利用国家重点实验室保存提供，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中；胎牛血清、DMEM和脂质体（Lipofectamine2000）购自美国Life公司，PCRBuffer和DNAMarker等试剂购自TaKaRa公司，荧光倒置显微镜购自日本Nikon公司。1.2TALEN载体构建

1.2.1TALEN打靶位点设计根据小鼠TLR3基因序列，标注出基因外显子及内含子范围，在翻译起始

位点所在的外显子处寻找限制性内切酶位点并设计

TALEN载体（TALEN1和TALEN2），进行基因敲除，TALEN载体设计原理见图1。

1.2.2TALEN模块组装根据TALEs蛋白的重复可变RVD与碱基的对应关系，组装TALEN模块。RVD组装采用GoldenGateKit试剂盒，TALEN打靶载体pTALEN-TLR3构建采用GoldenGateTALENandTALEffectorKit试剂盒。

图1TALEN打靶位点设计原理

Fig.1PrinciplediagramofTALENshootingsitedesign

1.2.3TALEN模块连接TALENs左右臂分两部分连接：首先是完成A、B部分的各自连接（以下分别称为T1LA、T1LB、T1RA、T1RB和T2LA、T2LB、T2RA、T2RB），然后分别将T1LA与T1LB、T1RA与T1RB、T2LA与T2LB、T2RA与T2RB连接，即完成TALEN第二次连接。

1.2.4TALEN质粒剪切活性验证通过脂质体方法以TALEN打靶载体pTALEN-TLR3瞬时转染RAW264.7细胞，转染后提取细胞DNA为模板，经PCR扩增后用T7核酸内切酶进行酶切，并检测目的基因完整性以验证TALEN质粒剪切活性。1.2.5基因敲除细胞系筛选细胞转染：以具有基因剪切活性的TALEN2进行细胞筛选，细胞培养生长至70%汇合度时进行脂质体转染。细胞筛选及培养：转染24h后用胰酶EDTA消化液消化RAW264.7细胞，稀释后转入新的细胞板，同时加入800μg/mLG418进行筛选，当出现单克隆时，挑取单克隆至96孔板中培养，长满后扩大至48孔中继续培养，细胞汇合生长至80%~90%时，胰酶消化后挑取一半的细胞提取DNA，然后PCR扩增目的片段并进行酶切鉴定，剩余细胞在原孔培养。阳性克隆酶切鉴定：采用T7核酸内切酶酶切鉴定RAW264.7细胞是

否为TLR3基因双敲除，其过程需经过两轮PCR扩增

和酶切。PCR扩增程序：95℃预变性5min；94℃30s，56℃30s，72℃2min，进行30个循环；72℃延伸10min。第一轮细胞裂解扩增出目的条带后，PCR产物采用T7核酸内切酶进行酶切鉴定，出现与预期结果一致的两条剪切产物，此为单敲细胞克隆；将T7核酸内切酶未能切开PCR产物的细胞克隆再次进行PCR扩增，与野生型细胞PCR扩增产物1∶1混合后，以T7核酸内切酶进行酶切鉴定，出现大小吻合的酶切产物，即为双敲细胞克隆。测序鉴定：提取酶切鉴定为TLR3基因双敲除的细胞克隆DNA，PCR扩增打靶位点及其上、下游目的基因，产物与pMD18-T载体连接，挑取8个阳性克隆送至深圳华大基因公司测序，在线比对分析测序结果，全为非3整数倍缺失的细胞克隆即为所需的基因纯合敲除细胞系。

2结果与分析

2.1

TALEN模块第一次连接及PCR鉴定结果TALENs左右臂分两部分连接，第一次完成A、B部分的各自连接。连接完成后即转化感受态细胞并涂布于含氨苄青霉素的琼脂培养基上，每个培养基挑3~5个克隆进行PCR鉴定，鉴定结果出现弥散条带