益肺宣肺降浊方对血管性痴呆大鼠海马神经元凋亡及p-CREB和CREB蛋白

益肺宣肺降浊方对血管性痴呆大鼠海马神经元凋亡及p-CREB和CREB蛋白表达的影响

王清碧1，唐 农2，吴 林3，蔡鑫昆1，毕信亚4，李天威3，李海沅3，赵清山5

【摘 要】摘 要 目的：观察益肺宣肺降浊方对血管性痴呆大鼠海马神经元凋亡及p-CREB 和CREB 蛋白表达的影响。方法：采用双侧颈总动脉夹闭再通法制备痴呆模型，随机分为空白组、模型组、石杉碱甲组、中药高剂量组、中药中剂量组和中药低剂量组。药物治疗30 天后，采用Tunel 检测神经细胞凋亡，Western Blot 检测大鼠海马CA1区cAMP∕PKA-CREB 信号通路相关因子p-CREB 和CREB 的蛋白表达。结果：①Tunel检测结果显示，模型组神经细胞凋亡明显；与模型组比较，各用药组神经细胞凋亡数目明显减少，有显著性差异（P＜0.01）；中药随着剂量的增加，其改善海马神经细胞凋亡的作用越明显，呈剂量正相关（P＜0.01），其中高剂量组与石杉碱甲组作用相当（P＞0.05）。②与空白组比较，模型组p-CREB、CREB蛋白表达均明显下降（P＜0.01）；与模型组比较，中药高、中剂量组p-CREB、CREB蛋白表达均明显升高（P＜0.01），其中中药高剂量组接近空白组水平（P＞0.05）；石杉碱甲组CREB 蛋白表达明显升高，与模型组比较有显著性差异（P＜0.01）。结论：益肺宣肺降浊方具有减少海马神经元凋亡和增加p-CREB和CREB蛋白表达的作用。 【期刊名称】《广西中医药》 【年(卷),期】2019(042)005 【总页数】5

【关键词】关键词 益肺宣肺降浊方；血管性痴呆；神经元凋亡；p-CREB；

CREB

【文献来源】https://www.zhangqiaokeyan.com/academic-journal-cn_guangxi-journal-traditional-chinese-medicine_thesis/0201275141838.html

·实验研究·

基金项目：国家自然科学基金项目（编号：81160435）；广西中医药大学青年基金项目（编号：2017QN025）

血管性痴呆（vascular dementia，VD）是由各种脑血管病引起的获得性、持续性智能损害综合征，临床中最突出的表现是学习和记忆等认知功能的下降。在发达国家中VD占全部痴呆患者的25%～50%，成为导致痴呆的第二大原因［1］。在所有的痴呆类型中，从某种程度上讲，血管性痴呆是可以防治的［2］。伴随着医疗技术水平的提高以及老龄化社会的到来，血管性痴呆的发病率越来越高，一方面给老年患者的身心健康带来严重的危害，另一方面也给家庭和社会带来繁重的经济和精神负担，因此，预防和治疗血管性痴呆受到越来越多人的关注。本实验参照吕氏造模方法［3］，采用两侧颈总动脉夹闭再通法制备VD 模型，通过Tunel法检测神经细胞的凋亡，Western Blot检测VD大鼠海马CA1 区cAMP∕PKA-CREB 信号通路相关因子p-CREB 和CREB 的蛋白表达，观察益肺宣肺降浊方对血管性痴呆大鼠海马神经元凋亡及p-CREB 和CREB蛋白表达的影响。现将实验结果报道如下。

1 实验材料

1.1 动物 SPF 级SD 雄性大鼠190 只，体质量200±20 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，合格证号：43004700002251。

1.2 主要药品及试剂 益肺宣肺降浊方免煎颗粒（相当于含生药量：黄芪15 g、

人参15 g、麦冬15 g、桔梗10 g、杏仁10 g、三七15 g、苏子15 g、石菖蒲15 g、酒大黄6 g），由广西中医药大学第一附属医院提供；石杉碱甲片（商品名“双益平”，国药准字H10960133，上海复旦复华药业有限公司）；p-CREB抗体（批号4276，美国Santa Cruz 公司）；CREB 抗体（批号4820，美国Santa Cruz 公司）；二抗（兔抗山羊，北京中杉金桥生物技术有限公司）。 1.3 主要器材 D700 型照相系统（日本NIKON）；BX60 型显微镜（OLYMPUS）；DW-86L490 型-80 ℃冰箱（青岛海尔特种电器有限公司）；BCD-268WBCS 型20 ℃冰箱（青岛海尔股份有限公司）；HYC-326A 型4 ℃冰箱（青岛海尔特种电器有限公司）；50121224 型离心机（THERMO FISHER 公司）；全自动石蜡切片机（德国MICRO）；转移脱色摇床（海门其林贝尔仪器制造公司）；电泳仪（北京百晶生物技术有限公司）；电热恒温水浴槽（上海医用恒温设备厂）。

2 实验方法

2.1 造模方法 参考文献［3］方法造模：动物于术前8 h 禁食，予10%水合氯醛3 ml∕kg 腹腔注射麻醉。所有的手术器械先高温灭菌，固定好大鼠，然后颈部去毛，碘伏消毒后，行颈正中切口，依次应用玻璃分针分离出双侧颈总动脉并用0 号丝线结扎，手术过程中注意不要牵拉迷走神经，阻断血流20 min，同时在大鼠距尾尖1 cm处断尾，放血约0.3 ml，然后松开丝线恢复大脑血流10 min，再次阻断血流20 min，如此重复3次，即3 次缺血20 min、再灌注10 min 的方式，造成VD模型。第3 次血流再灌注后，切口给予适量头孢粉末预防感染，随即行皮肤缝合，放回笼中正常饲养。空白组只分离双侧颈总动脉，不结扎也不阻断。