应用人工神经修复大鼠坐骨神经损伤的实验研究①
王晓亮，杨朝阳，李晓光，张皑峰
【摘 要】[摘要] 目的 观察应用复合碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)-壳聚糖导管修复大鼠周围神经损伤的效果。方法 成年Wistar大鼠25只分为假手术组(n=10)、单纯损伤组(n=5)和人工神经修复组(n=10)。假手术组仅暴露坐骨神经5 mm，单纯损伤组暴露坐骨神经并切断，人工神经修复组以复合bFGF-壳聚糖导管桥接缺损。术后对实验动物的坐骨神经进行大体观察，对运动进行行为观察，以及组织化学和免疫组织化学方法评价神经再生情况和靶肌肉恢复情况。结果 术后5周，与单纯损伤组相比，人工神经修复组运动功能有一定程度恢复。人工神经修复组再生的坐骨神经已经通过bFGF-壳聚糖导管越过缺损并与远端相连接。免疫组织化学方法显示，坐骨神经再生段可观察到神经微丝(NF)阳性和S-100阳性纤维。应用Masson染色方法，可观察到人工神经修复组腓肠肌去纤维化程度相对于单纯损伤组有明显改善。结论 应用bFGF-壳聚糖导管能有效修复周围神经损伤并使大鼠运动功能得到改善。 【期刊名称】中国康复理论与实践 【年(卷),期】2012(018)006 【总页数】4
【关键词】[关键词] 周围神经损伤；人工神经移植；神经再生；碱性成纤维细胞生长因子；壳聚糖；功能恢复
周围神经损伤是临床外科常见的疾病，会造成患者相关肢体的运动功能障碍和感觉功能缺失。临床治疗短距离周围神经损伤常施行端端吻合术，而治疗长距离周围神经损伤则采用自体或异体神经移植的方法。这些方法会对供体造成伤
害，且异体移植会伴有免疫排斥的风险。近年来随着组织工程的发展，不断有学者尝试组织工程的方法构建人工神经来治疗周围神经缺损[1]。应用组织工程方法可以有效克服目前临床上治疗周围神经损伤的不足。组织工程化的人工神经通常包括能为施万细胞再生提供支架的桥梁以及促进神经轴索再生的成分。壳聚糖是一种来源于自然界的多聚糖，可通过人工控制其乙酰化程度来调节其降解速度，在医学和生物学领域都有极高的应用价值。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是具有有丝分裂源活性的阳离子多肽，具有保护神经元和促进神经再生的作用[2]。本次实验观察采用bFGF-壳聚糖导管构成的人工神经修复大鼠坐骨神经缺损。
1 材料和方法
1.1 材料 Wistar大鼠25只，体重200～220 g，由首都医科大学实验动物中心提供。随机分为假手术组(n=10)，单纯损伤组(n=5)和人工神经修复组(n=10)。主要试剂：小鼠来源抗大鼠神经微丝多克隆抗体(NF，SIGMA公司)、兔来源抗大鼠S-100蛋白(中杉金桥)。 1.2 方法
1.2.1 动物模型制备 用6%水合氯醛腹腔内注射麻醉实验大鼠(30 mg/kg)，对左后肢备皮后固定于鼠板上，常规消毒。沿左侧股后部依次切开皮肤、皮下组织，分离半腱肌、半膜肌，暴露左侧坐骨神经主干并游离干净。
假手术组：暴露5 mm坐骨神经后不做任何处理，立即缝合肌肉和皮肤。 单纯损伤组：暴露坐骨神经后，切除坐骨神经造成5 mm缺损，待其自然回缩后，缝合肌肉和皮肤。
人工神经修复组：于股中部切除坐骨神经造成5 mm缺损，以7/0无创缝合针
在手术显微镜下，将人工神经缝合于神经外膜上，并使两断端分别进入导管(导管长9 mm)内约2 mm，逐层缝合肌肉和皮肤。
1.2.2 取材及固定 术后5周分别对各组实验动物以4%多聚甲醛溶液经心脏灌注固定，游离并切取左侧坐骨神经相应再生段，同时取双下肢腓肠肌、比目鱼肌和趾长伸肌。所取组织经蔗糖梯度脱水后，将新生的神经组织和对照组相应神经干沿长轴方向纵向恒冷箱切片，切片厚12 μm；取腓肠肌标本中部，恒冷箱切片，切片方向垂直肌纤维走行，切片厚16 μm。
1.2.3 免疫组织化学染色 神经组织切片经PBST洗3次，每次5 min，入5%羊血清封闭30 min后，进行S-100和NF双重免疫组织化学染色。小鼠抗NF滴度为1∶50，兔抗S-100滴度为1∶100，一抗72 h后，分别加入Texas-red标记的山羊抗鼠IgG荧光二抗(Jakson公司)和Cy2标记的山羊抗兔IgG荧光二抗(Jakson公司)，滴度均为1∶100，室温避光过夜，缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察。
1.2.4 组织化学染色 取各组腓肠肌中段横切片，入Masson复合染液10 min，0.2%醋酸稍洗，5%磷钨酸分色5 min后入0.2%醋酸浸洗3 min，入苯胺蓝溶液5 min，0.2%醋酸水洗两次，每次3 min，常规脱水透明封片。光镜下观察肌肉横截面及纤维化情况。
1.2.5 靶肌肉肌纤维面积比较 应用Image-pro plus 6.1计量并比较靶肌肉肌纤维横截面积。
1.3 统计学分析 数值以(xˉ±s)表示，采用SPSS 16.0软件进行t检验。
2 结果
2.1 术后大体观察 术后1周时，单纯损伤组和人工神经修复组大鼠均出现术侧
应用人工神经修复大鼠坐骨神经损伤的实验研究
