原料乳的质量测定
一、实验目的
1.1 了解生乳的国家标准及相关质量指标要求 1.2 掌握相关质量指标的检测方法及原理 二、实验内容
2.1 乳总固形物的测定 2.2 新鲜度的测定
2.3 原料乳抗生素残留的测定 2.4 原料乳菌落总数的测定 三、实验原理
3.1 乳固形物测定原理
先分别测定出乳及乳制品中的总固体含量、脂肪含量（如添加了蔗糖等非乳成分含量，也应扣除），再用总固体减去脂肪和蔗糖等非乳成分含量，即非脂乳固体。
3.2 乳新鲜度测定的原理
美兰还原试验是用来判断原料乳新鲜程度的一种色素还原试验。新鲜乳加入亚甲基兰后染为蓝色。如污染大量微生物产生还原酶使颜色逐渐变浅，直至无色，通过测定颜色变化时间，间接推断出鲜奶的卫生质量。
3.3 原料乳抗生素残留测定的原理
培养基预先混合嗜热脂肪芽孢杆菌芽胞，并含有pH指示剂（溴甲酚紫）。加入样品并孵育后，若该样品中不含有抗生素或抗生素的浓度低于检测限，细菌芽胞将在培养基中生长并利用糖产酸，pH指示剂的紫色变为黄色。相反，若样品中含有高于检测限的抗生素，则细菌芽胞不会生长，pH指示剂的颜色保持不变，仍为紫色。
3.4 原料乳菌落总数测定的原理
菌落总数：菌落总数就是指在一定条件下(如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等)每克(每毫升)检样所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。 四、实验主要仪器与设备
4.1 原料乳抗生素残留测定原料及设备 4.1.1 原料及试剂 灭菌脱脂乳；PCA培养基
4.1.2 设备
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下
恒温培养箱；恒温水浴锅；100μL、200μL微量移液器及吸头；无菌试管：18×180
4.2 原料乳新鲜度测定
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下
恒温培养箱；恒温水浴锅；100μL、200μL微量移液器及吸头；无菌试管：18×180
4.3 乳总固形物测定原料及设备 4.3.1原料及试剂
除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为三级水。
1）平底皿盒：高 20 mm～25 mm，直径 50 mm～70 mm 的带盖不锈钢或铝皿盒，或玻璃称量皿。
2）短玻璃棒：适合于皿盒的直径，可斜放在皿盒内，不影响盖盖。 3）石英砂或海砂：可通过500μm孔径的筛子，不能通过180μm孔径的筛子，并通过下列适用性测试：将约20g的海砂同短玻棒一起放于一皿盒中，然后敞盖在100 ℃±2 ℃的干燥箱中至少烘2h。把皿盒盖盖后放入干燥器中冷却至室温后称量，准确至0.1 mg。用5mL水将海砂润湿，用短玻棒混合海砂和水，将其再次放入干燥箱中干燥4 h。把皿盒盖盖后放入干燥器中冷却至室温后称量，精确至0.1mg，两次称量的差不应超过0.5mg。如果两次称量的质量差超过了0.5mg，则需对海砂进行下面的处理后，才能使用：
将海砂在体积分数为25 %的盐酸溶液中浸泡3d，经常搅拌。尽可能地倾出上清液，用水洗涤海砂，直到中性。在160 ℃条件下加热海砂4 h。然后重复进行适用性测试。
4.3.2 仪器与设备
天平：感量为0.1 mg；干燥箱；水浴锅 4.4 菌落总数检测设备与材料 4.4.1 试剂和原料 PCA培养基：120ml/瓶； 4.4.2 仪器和设备
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
冰箱：2 ℃～5 ℃；恒温培养箱：28 ℃±1 ℃；均质器；恒温振荡器；显微镜： 10×～100×；电子天平：感量0.1 g；无菌锥形瓶:容量500 mL、250 mL；无菌广口瓶：500 mL；无菌吸管：1 mL(具0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)；
无菌平皿：直径90 mm；无菌试管：10 mm×75 mm；无菌牛皮纸袋、塑料袋。 五、实验步骤
5.1 原料乳抗生素残留测定
样品9ml置于灭菌空试管中（平行两份），阴性对照管和阳性对照管各1份（老师提供）。
所有试管80℃±2℃水浴加热5min，冷却至37℃，加入测试菌液1ml，轻轻旋转试管混匀。37℃水浴2h，加入4%TTC水浴液0.3ml，混匀后37℃，水浴避光培养30min，观察颜色变化。
5.2 原料乳新鲜度测定
吸取10ml牛奶于灭菌空试管中（平行2份），在水浴中加热到38℃，再加入亚甲基兰溶液1ml混匀。
将试管放入水浴中，每30min观察1次褪色情况，并记录每个样品褪色时间。 5.3 乳总固形物测定
在平底皿盒中加入20g石英砂或海砂，在100 ℃±2 ℃的干燥箱中干燥2 h，于干燥器冷却0.5 h，称量，并反复干燥至恒重。称取5.0 g（精确至 0.0001 g）试样于恒重的皿内，置水浴上蒸干，擦去皿外的水渍，于100 ℃±2 ℃ 干燥箱中干燥3 h，取出放入干燥器中冷却0.5 h，称量，再于100 ℃±2 ℃ 干燥箱中干燥 1 h，取出冷却后称量，至前后两次质量相差不超过 1.0 mg。试样中总固体的含量按式计算：
m1-m2X??100
m式中：
X——试样中总固体的含量，单位为克每百克（g/100g）； m1——皿盒、海砂加试样干燥后质量，单位为克（g）； m2——皿盒、海砂的质量，单位为克（g）； m——试样的质量，单位为克（g）。
5.4 菌落总数检测 5.4.1 样品的稀释
5.4.1.1 固体和半固体样品：称取25 g样品至盛有225 mL 灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为1:10稀释液。或放入盛有225 mL无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10的样品匀液。
5.4.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品至盛有 225 mL 无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 的样品匀液。
5.4.1.3 取1 mL 1:10 稀释液注入含有9 mL 无菌水的试管中，另换一支1 mL无菌吸管反复吹吸,此液为1:100 稀释液。
5.4.1.4 制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1 mL无菌吸管。
5.4.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择 2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液，在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1 mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1 mL样品稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。
5.4.1.6 及时将15 mL～20 mL冷却至60 ℃的PCA培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
5.4.2 培养
待琼脂凝固后，将平板倒置，28℃±1℃培养5d，观察并记录。 5.4.3 菌落计数
肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位（colony forming units，CFU）表示。
选取菌落数在 10 CFU～150 CFU 的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。 六、实验结果
6.1 原料乳抗生素残留测定 组别 变化 阴性对照 粉红色 阳性对照 淡黄色 第一组 浅红色 第二组 浅红色 6.2 原料乳新鲜度测定
11:15 进行新鲜度测定；12:15 试样呈浅蓝色；12:40 试样褪色；褪色时间1小时25分。
6.3 乳总固形物测定 第一次（g） 第二次（g） 由上述数据得出
样品1 ：m2=65.2807（g），m1=64.6609（g）；
1 64.6618 64.6609 实验前 2 65.8617 65.8612 1 65.2815 65.2807 实验时 2 66.4265 66.4258 m-m65.2807-64.6609X?21?100??100?12.18(g/100g)m5.0872样品2 ：m2=66.4258（g），m1=65.8612（g）；
X?m2-m166.4258-65.8612?100??100?11.18（g/100g） m5.0499得出平均值为?X=11.68（g/100g）
5.4 菌落总数检测 浓度 空白 100 10-1 10-3 10-4 七、结果分析与讨论
实验结果达到预期。这个实验要注意的地方是做培养基的时候，动作要快，不然就让其他细菌污染培养基。通过这次实验了解生乳的国家标准及相关质量指标要求，还有掌握相关质量指标的检测方法及原理。
菌落情况（个） 合格 多不可计 多不可计 多不可计 320 100 10-1 10-3 10-4 浓度 菌落情况（个） 多不可计 多不可计 多不可计 332
原料乳实验报告
