小鼠PARP1基因RNAi表达载体对Lewis细胞
株的影响
作者：王铁君 邹永巍 刘林林 杨海山
【摘要】 目的 观察PARP
1基因RNAi表达载体对Lewis肺癌
细胞的抑制及凋亡情况。方法 以脂质体Lipofectimine? 2000介导，将PARP
1
1308的siRNA表达载体转染Lewis肺癌细胞株，将其
分为空白对照组、错义序列组、siRNA组，2Gy照射组、2Gy照射+错义序列组、2Gy照射+siRNA组。应用MTT法检测转染细胞抑制率、流式细胞术分析转染siRNA后细胞的凋亡，并应用RT
PCR检测转染细
胞Parp1 mRNA表达水平。结果 siRNA转染组及2Gy照射组的吸光度值与空白对照组比较差异有显著意义；2Gy照射组+ siRNA组的吸光度值与2Gy照射组、siRNA组比较差异有显著意义。错义序列组与正常对照组比较无显著差异；2Gy照射组+错义序列组与2Gy照射组比较无显著差异。2Gy照射组+ siRNA组对Lewis肺癌细胞的抑制率最高。RTPCR检测结果显示转染细胞Parp1 mRNA表达水平降低。siRNA转染、2Gy照射可诱导Lewis肺癌细胞凋亡，与正常对照组比较差异显著(P＜0.05)，并且siRNA转染可增加2Gy照射引起的Lewis肺癌细胞凋亡。结论 针对PARP
1的RNAi可以提高Lewis肺癌细胞的抑制率及放疗
引起的肿瘤细胞的凋亡。
【关键词】 PARP；RNAi；细胞凋亡；肿瘤细胞
聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶
1（PARP
1）在DNA修复、细胞
死亡、增殖分化等方面发挥着重要作用〔1，2〕，研究表明通过抑制PARP
1活性可抑制PARP
1介导的DNA修复机制，提高放疗和化
疗对肿瘤细胞DNA的损伤效果〔3，4〕，且肿瘤治疗效果满意。但阻断剂技术本身存在诸多缺陷，这极大地限制其应用于临床肿瘤治疗。而小片段干扰核糖核酸(small interference RNA，siRNA)技术能较好地解决应用阻断剂所带来的问题，从而可为肿瘤放射基因治疗研究提供新途径。本文应用PARP细胞株，观察PARP
1 材料与方法
1.1 材料 TRIzol Raegent、脂质体LipofectimineTM2000、DMEM培养基、胎牛血清，Invitrogen公司；MTT，Sigma公司。Lewis肺癌细胞株，本室保存。pGPU6/GFP/Neo定、筛选〔5〕。
1.2 方法
1.2.1 pGPU6/GFP/Neo
Parp1
1308转染Lewis肺癌细胞株 Parp1
1308，本室构建、鉴
1
1308的RNAi载体转染小鼠Lewis肺癌
1的RNAi对小鼠Lewis肺癌细胞株凋亡的影响。
取对数生长期的Lewis肺癌细胞，调整细胞浓度为6
×107/L，取100 μl接种于96孔板。设空白对照组、错义序列组（错义序列组序列与Parp1基因的siRNA序列有相同的GC组成，但与小鼠的 mRNA没有明显的同源性，作为阴性对照）、siRNA组，2Gy照射组、2Gy照射+错义序列组、2Gy照射+siRNA组，每组3复孔，接种24 h后弃去上清，以脂质体LipofectimineTM 2000介导，将siRNA表达载体转染Lewis肺癌细胞株，具体操作按说明书进行。置于37℃、5% CO2、无血清培养基中继续培养6 h，更换完全培养基继续培养。
1.2.2 细胞抑制率检测 在各组细胞转染24 h后分别加入MTT 20 μl，培养箱中4 h，弃上清加入DMSO，振荡15 min，酶标仪检测吸光度（A）值。计算细胞抑制率。
1.2.3 转染siRNA后细胞凋亡的检测 各组细胞以1.5×105/L密度接种于25 cm2培养瓶，转染后继续培养48 h，胰酶消化、离心收集并悬于PBS中，4℃、70%乙醇固定30 min，用含RNase及碘化丙锭（PI）的染色液染色30 min。应用流式细胞仪进行细胞凋亡分析。
1.2.4 转染细胞Parp1 mRNA表达水平的检测 各组细胞以1.0×105/L密度接种于6孔板，24 h后 弃去上清，转染siRNA，24 h后胰酶消化，离心收集。TRIzol提取各组细胞总RNA，取1 μg总RNA进行RT
PCR扩增。以Parp1的引物5′
TCCCAAGGACTCCCTCCGCATGG
3′、5′CTTTGCCTGCCACGCCTCCAGCC3′进行RTPCR，
扩增片段为210 bp，检测Parp1 mRNA的表达情况。以β
GTCAGGTCATCACTATCGGCAATAGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT
3
′
，
actin （5′5
′
3′）为内参照。将PCR扩增产物在1.5%
的琼脂糖凝胶上电泳。 2 结 果
2.1 siRNA对Lewis肺癌细胞生长的抑制作用 siRNA转染组及2Gy照射组的吸光度值与空白对照组相比差异有显著意义(P＜0.05)；2Gy照射组+ siRNA组的吸光度值与2Gy照射组、siRNA组比较差异有显著意义（P＜0.05)。错义序列组与正常对照组比较差异无显著性；2Gy照射组+错义序列组与2Gy照射组比较差异无显著意义。2Gy照射组+ siRNA组对Lewis肺癌细胞的抑制率最高。
2.2 siRNA对Lewis肺癌细胞凋亡的影响 siRNA转染、2Gy照射可诱导Lewis肺癌细胞凋亡，与正常对照组比差异显著（P＜0.05），并且siRNA转染可增加2Gy照射引起的Lewis肺癌细胞凋亡（P＜0.05）。
2.3 转染细胞Parp1 mRNA表达水平 见图1。各组210 bp处均可见清晰条带，siRNA和2Gy照射组+ siRNA组条带明显减弱，各组内参照β
actin条带一致。
3 讨 论
PARP是一类存在于多数真核细胞(酵母除外)中的蛋白质翻译后修饰酶〔6〕，在DNA 的损伤修复、DNA复制、细胞增殖分化调控、细胞凋亡、基因组的稳定方面发挥着重要的作用〔7〕。PARP制是辐射敏感性增高的主要原因，采用PARP
1活性抑
1抑制剂可增强几种抗
肿瘤因子杀伤肿瘤细胞的效能。但是由于PARP是一个多成员的蛋白质家族，化学抑制剂可能会带来非特异性抑制效果，给特定PARP成员功能的研究带来不便。而且PARP副作用仍不清楚。
siRNA是一种简单的、有效的代替基因敲除的工具，其作用机制是通过活化的小干扰RNA靶向降解目的mRNA，从而使目的基因表达沉默。21
23nt的短片断双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA
1特异性阻断剂还处于实验阶段，毒
为靶目标降解特定的mRNA。RNA干扰技术已经广泛用于基因功能的研究以及多种疾病的治疗，如乙型肝炎、丙肝、流感、艾滋病等〔8～10〕。本研究利用RNA干扰技术，将构建的针对PARP1的RNAi裁体转染小鼠Lewis肺癌细胞株，结果表明siRNA转染组及2Gy照射组吸光度值与空白对照组比较差异显著；2Gy照射组+ siRNA组的吸光度值与2Gy照射组、siRNA组比较差异显著。错义序列组与正常对照组比较无显著差异；2Gy照射组+错义序列组与2Gy照射组比较无显著差异，2Gy照射组+ siRNA组对Lewis肺癌细胞的抑制率最高，RT
小鼠PARP1基因RNAi表达载体对Lewis细胞株的影响
