BET bromodomain蛋白在人胚胎干细胞造血分化中的作用研究

BET bromodomain蛋白在人胚胎干细胞造血分化中的作

用研究

冯子岑，温玉琪，王梦鸽，涂茜，王洪涛，王征宇*，周家喜*

【摘 要】摘要 目的：探讨BET bromodomain蛋白在人胚胎干细胞造血分化中的作用。方法：应用人胚胎干细胞单层造血分化体系，通过免疫荧光技术、流式细胞术及实时定量PCR技术，研究BET bromodomain蛋白抑制剂I-BET 151对造血分化的影响，并在不同分化阶段添加I-BET 151探讨其在造血分化过程中的作用阶段。结果：I-BET 151能够显著抑制CD43＋造血干/祖细胞的产生，并且在APLNR＋侧板中胚层生成、CD34＋CD31＋生血内皮产生及内皮细胞生血转化3个阶段添加I-BET 151对CD43＋造血干/祖细胞的产生均有显著抑制作用。结论：人胚胎干细胞造血分化过程中添加BET bromodomain蛋白抑制剂I-BET 151，能够抑制CD43＋造血干/祖细胞的产生，并进一步证实BET bromodomain蛋白在造血分化各个阶段均发挥有作用。 【期刊名称】中国实验血液学杂志 【年(卷),期】2018(026)004 【总页数】8

【关键词】关键词 人胚胎干细胞；造血分化；BET bromodomain蛋白；I-BET 151

基金项目：国家自然科学基金（31500949），中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目（2016-I2M-1-018，2016-I2M-3-002），天津市重点应用基础一般项目（批准号：16JCZDJ33100）

*共同通讯作者周家喜，研究员．E-mail：zhoujx@ihcams．ac．cn；王征宇，

教授．E-mail：zw12us@hotmail．com 2018-01-30收稿；2018-05-15接受

造血干细胞移植是治疗多种恶性血液疾病的重要治疗手段，然而目前造血干细胞供者不足严重制约着这一治疗手段的广泛应用。人多能干细胞（human pluripotent stem cells，hPSC）包括人胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESC）及人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSC），具有自我更新和多向分化潜能，理论上能够分化为人体的各种类型的细胞［1］，包括造血干/祖细胞及各种功能血细胞。虽然近年来在hPSC向造血干/祖细胞分化方面取得了一系列进展，但依然面临着hPSC体外造血分化效率低及分化得到的造血干/祖细胞不具有长期移植能力的问题，而造成这些问题的原因是对hPSC造血分化调控的分子机制了解甚少。与体内造血发育过程类似，hPSC体外造血分化也依次经历了中胚层-生血内皮-内皮细胞生血转化（endothelial-to-hematopoietic transition，EHT）3个过程［2］。研究表明，可以分别使用 APLNR、CD31、CD34及CD43表面分子标记hPSC造血分化过程中依次产生的侧板中胚层细胞、生血内皮细胞及造血干/祖细胞［3］。目前，对于hPSC造血分化调控的研究主要集中在信号通路分子及转录因子，而对表观遗传修饰在造血分化中的作用研究较少。组蛋白修饰是组蛋白在相关酶的作用下发生甲基化、乙酰化及泛素化等多种共价修饰，这些修饰通过影响组蛋白与DNA之间的亲和性调控染色质的凝集或疏松状态，从而调控基因的转录活性［4］。赖氨酸乙酰化是组蛋白重要的修饰形式，赖氨酸乙酰化识别是组蛋白乙酰化参与表观遗传调控的关键步骤［5］。溴结构域（bromodomain，BRD）蛋白结构域能够特异性识别并结合组蛋白上乙酰化

的赖氨酸，随后通过招募染色质调控因子调控基因的转录［6］。Bromodomain and extra terminal（BET）蛋白属于 BRD蛋白家族，由BRD2、BRD3、BRD4和BRDT 4个成员组成［7］。最近有研究发现，敲低BRD4能够抑制小鼠胚胎干细胞造血分化［8］，但是BET蛋白是否在人胚胎干细胞造血分化过程中发挥作用及作用阶段仍不清楚。本研究利用已建立的hESC逐级造血分化模型［9］，使用BET蛋白小分子抑制剂I-BET151探索BET蛋白在人胚胎干细胞造血分化中的作用及作用阶段。

材料和方法

试剂与仪器

Growth Factor Reduced Matrigel基质和Matrigel基质均购于美国Becton Dickinson公司。培养基mTeSR、Custom mTeSR1、Accutase和Dispase均为美国Stem Cell Technologies公司产品。DMEM/F12为美国Gibco公司产品。Activin A、BMP4、FGF-basic、VEGF均为美国Peprotech公司产品。SB431542为美国Stemgent公司产品。免疫荧光抗体：CD43-mouse clonal IgG抗体为美国Santa Cruz Biotechnology公司产品。Donkey anti-Mouse IgG Alexa Fluor 594二抗为美国Invitrogen公司产品。流式抗体：APLNR-APC为美国R＆D公司产品，CD31-PE、CD34-APC、CD43-PE为美国Becton Dickinson公司产品。Reverse Transcription System为Promega公司产品，PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix为美国Thermo Fisher Scientific公司产品，PCR引物均由美国Invitrogen公司合成。 人胚胎干细胞的培养与传代

人胚胎干细胞株H1购于美国Wicell干细胞库，细胞在包被有Matrigel基质

的培养板中，培养悬于mTeSR培养液培养，每日更换培养液。当H1细胞密度达到70%-80%时进行传代，使用2 U/ml的dispase酶在 37℃孵箱中孵育 5-8 min，加入DMEM/F12基础培养液洗3次，然后使用移液管尖端划过培养皿底部，刮动悬浮H1细胞克隆，收集此悬液，300×g离心5 min。用mTeSR培养液重悬沉淀，将细胞悬液平均分入新的培养板中。H1单细胞传代：使用1 mg/ml Accutase酶37℃消化3-5 min，然后加入DMEM/F12基础培养液吹打细胞，以获得单细胞悬液，300×g离心5 min。用添加了Y-27632（5×10-3 mol/L）的mTeSR培养液重悬细胞沉淀，转移到新的培养板中。 人胚胎干细胞的造血分化

人胚胎干细胞造血分化按照已建立的方法进行［10］。将人胚胎干细胞消化成单个细胞后，以1．7×104细胞/孔接种于预先用Growth Factor Reduced Matrigel包被的24孔板中。接种24 h后，更换造血诱导分化液，此时标记为造血分化d 0。分化d 0-2，向Custom mTeSR1中添加50 ng/m l activin A和40 ng/ml BMP4；d 2-4，在 Custom mTeSR1培养液中添加40 ng/m l VEGF和50 ng/m l bFGF；d 4-7，向Custom mTeSR1培养液中添加40 ng/ml VEGF，50 ng/ml bFGF和20μmol/L SB-431542。在造血分化过程的不同阶段，使用I-BET 151 500 nmol/ml处理细胞，检测BET bromodomain蛋白在人胚胎干细胞造血分化过程中的作用以及作用阶段。 CD43造血细胞表面m arker表达的免疫荧光检测

用PBS将待染色的细胞清洗1次。利用4%PFA室温固定细胞15 min，PBS清洗样品3次，每次5 min。然后加入0．2%PBT室温通透细胞，20 min后用PBS清洗样品3次。加入2%BSA封闭液4℃处理细胞1 h后，将小鼠抗

CD43的抗体以1∶100稀释后进行标抗，4℃孵育过夜。24 h后用PBS洗净未结合的一抗，并以1∶300的浓度稀释二抗，室温孵育50 min，以 1∶100浓度加入 DAPI（10μg/μl），染 15 min，用PBS洗净，利用双转盘共聚焦显微镜观察并拍照。

造血分化的流式细胞术分析

Accutase酶将待检测细胞消化至单细胞状态，300×g离心5 min，0．2%BSA重悬细胞，为确保细胞保持单细胞状态，利用200目筛网过滤细胞。室温标记目的抗体，摇床上孵育30 min后，用PBS洗细胞后利用Canto2仪器进行检测，Flowjo软件进行数据分析。 RNA的提取

将6孔板中细胞培养至d 7，加入1 ml TRIzol裂解、收集细胞后加入200μl氯仿快速震荡30-60 s，室温静置3 min。4℃ 300×g离心15 min，此时1．5 ml离心管中液体分为3层：RNA存在于上层水相。轻轻将上层水相转移至新的无RNA酶的1．5 ml离心管中，并加入500μl异丙醇，混匀离心管，室温静置5 min。4℃300×g离心5 min。弃上清，加入1 ml无RNA酶的水配置的75%乙醇洗涤沉淀，4℃350×g离心5 min。弃上清，将其放入超净台中室温晾干，约10 min可见白色沉淀变为透明。然后加入适量（15-40μl）无RNA酶的水溶解RNA，55℃金属浴5 min。最后将提取的RNA利用NanoDrop仪器测定RNA浓度，未用完的RNA置于-80℃保存。 造血相关基因表达的实时定量PCR检测

提取诱导d 7分化细胞的总RNA，用Reverse Transcription System反转录试剂盒进行反转录而得到cDNA。反转录后用PowerUpTM SYBRTM Green