简介
蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot，简称WB。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。蛋白质免疫印迹（Western Blot）是将电泳后的细胞或组织总蛋白从凝胶电泳转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，利用抗原抗体反应，用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。现已广泛应用于基因在蛋白质水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
应用范围
检测基因在蛋白质水平的表达，是一种对蛋白质表达水平半定量的检测方法。
使用实例
1）如2015年发表在Cell Stem Cell（ChangHui Park et al., 2015, Cell Stem Cell）上的一篇文章（介绍神经精神疾病建模过程使用基因条件敲除，发现NRXN1中杂合突变引起突触传递缺陷现象，证明人类神经元中杂合NRXN1突变会伴随CASK蛋白表达上调），作者分析了mRNA水平包括CASK mRNA（使用定量PCR方法，图A）和蛋白水平的变化（使用LI-COR Odyssey 定量Western Blot方法，图B），文章显示cKO和cTr NRXN1突变体iN细胞中CASK蛋白水平增加60％-80％，定量PCR和定量Western Blot 结果相辅相成，与其他方法共同揭示了NRXN1的杂合失活直接损害人类神经元突触功能。
A：总mRNA水平定量分析用qRT-PCR方法
B：蛋白表达差异定量分析LI-COR Odyssey进行定量Western Blot成像分析
2）2016年发表在Neuron(Rani et al l., 2016, Neuron)上的文章（介绍一个灵长类lncRNA-lncND在神经元发育过程中调节Notch信号通路）中，内源性NOTCH-1和NOTCH-2 mRNA（定量PCR方法）和蛋白的表达（LI-COR Odyssey 定量Western Blot方法）在miR-143-3p模拟物存在下显着下调（图D和F）。Notch信号通路的下游靶标HES1和HEY1也被下调（图E），定量PCR和定量Western Blot方法证实miR-143-3p对该通路的影响。
D、E：mRNA水平验证miR-143-3p对于Notch1和2表达的调节作用
F、G：蛋白表达水平验证miR-143-3p对于Notch1和2表达的调节作用
实验流程图
详细步骤
蛋白样品制备
单层贴壁细胞总蛋白的提取：
1）倒掉培养液，将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液
2）向培养皿中加入裂解液，通常6孔板150-200 μL/孔，12孔板50-60 μL/孔，冰上放置，摇床20 min
3）用勺子刮下细胞，并吸出液体至1.5 mL离心管中，勺子在处理不同样本前清水洗净、擦干（注意冰上操作）4）超声处理（可选）注意蛋白悬液放于冰上，15 sec处理，每次处理后清水洗探头、擦干，再做下一个
5）于4 ℃下，12000 rpm离心5 min
6）将离心后的上清分装转移倒1.5 mL的离心管中放于-80 ℃保存。
组织中总蛋白的提取：
1）将200 mg组织块剪碎，置于1 mL裂解液中（5 ml离心管）
2）匀浆器进行匀浆，注意冰上操作，匀浆后置于冰上
3）10,000 g, 4 ℃,离心10 min（5 mL管）
4）取上清至1.5 mL管，12,000 g, 4 ℃,离心 60 min
5）取上清至新1.5 mL管，-80 ℃储存
蛋白含量的测定：
1）从-20 ℃取出1 mg/mL BSA，室温融化后，备用
2）取7个5 ml离心管，分别加入1 mg/mL BSA：0、10、20、40、60、80、100 μL，用蒸馏水补足各管至100 μL
3）样本取5 μL，加蒸馏水95 μL，使总量亦为100 μL，混匀
4）各管加G250溶液2 mL混匀，室温静止2分钟
5）混匀后，在生物分光光度计上比色分析，测定595 nm的光吸收，测定时浓度由低到高
6）于Excel根据标准品绘制标准曲线，根据得出的公式计算样本浓度。
SDS－PAGE电泳
清洗玻璃板：
一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
灌胶与上样：
1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶。（可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽的左、右和下部封边）；
2）按前面方法配10％下层胶（15 mL，两块胶，每块胶在6.5 mL左右），加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶后胶上加一层正丁醇（1 mL左右），液封后的胶凝的更快（也可用蒸馏水封胶）；
3）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。弃去正丁醇，用水冲洗，并用吸水纸将水吸干；
4）等待胶凝固期间可计算含50-100 μg蛋白的溶液体积即为上样量（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量）。
5）取出上样样品至200 μL的EP管中，加入4×上样缓冲液及DTT至终浓度均为1×（上样总体积一般不超过30 μL）。上样前要将样品于沸水中煮5-10 min使蛋白变性（亦可以使用PCR仪进行变性，加快速度，这样就不用 将水煮沸了）。
6）按前面方法配5％的上层胶（6 mL，两块胶），加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中（从梳子的一头开始插）。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小（也提示胶已经凝固），从而使加样孔的上样体积减小，所以在上层胶凝固的过程中要在两边补胶（不补胶问题也不大）。
7）等待上层胶凝固期间配制1×电泳缓冲液。加入1×电泳缓冲液，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。电泳缓冲液一定要加至超过玻璃板的上缘（量要足够多），否则电泳期间会出现电流过低的现象，进而影响电泳的效果。
8）上样(注意：最外两泳道易跑歪，尽量不用)，Marker 6 μL（Marker加在最边上的加样孔中），样本20-30μL。
电泳：
1）电压100 V，电流300 mA,功率50 W，时间1.5 hour(电泳15分钟后可调节电压到130 V)
2）电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜（一般要让目的条带跑过分离胶的1/3比较好）。
3）电泳结束前20分钟配制1X转膜缓冲液。
转膜：
1）转一张膜需准备4张滤纸和1张硝酸纤维素膜
切滤纸和膜时一定要戴手套（因为手上的蛋白会污染膜）。将切好的硝酸纤维素膜和滤纸置于1X转模缓冲液浸湿。
2）夹子黑的一面：海绵-2张滤纸-胶-NC膜-2张滤纸-海绵。将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。在垫子上垫二层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动）
3）先将玻璃板撬开，随后将浓缩胶轻轻刮去，小心剥下下层胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻璃棒擀去气泡。将硝酸纤维素膜盖于胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖2张滤纸并除去气泡（膜盖下后不可再移动）。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。
4）整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。如果同时做两块胶，转膜的时候应记住样本的位置。
5）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用100 V转移1.5 h。实际上应该根据蛋白分子量的大小确定转膜时间，对于小分子量的蛋白，转膜时最好垫两块硝酸纤维素膜，以免转膜过头，因为如果第一张膜上蛋白质已经转过了，第二张膜上还有蛋白质可以进行检测；对于大分子量的蛋白，转膜时电压要高一点，一般80-100 V，时间也要延长一点，开始最好也用两块膜，特别是务必注意加强降温措施。当然转膜是要摸条件的，最好刚开始做的时候摸个转膜的时间梯度。如果由于时间原因来不及做下面实验，可以在4度下12 V转膜过夜；硝酸纤维素膜建议使用0.22 μm的小孔径膜，不容易转膜过头；不同的转膜装置，转移效率是不一样的，换用转膜装置后，最好再摸个条件；转膜时电极方向注意是膜正胶负。如果同时做两块胶，转膜结束应在膜上做标记，以便查询相应样本。
6）转膜结束前配制封闭液（5%脱脂牛奶)及1X TBST缓冲液。
免疫反应
封闭：
将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2 h。
一抗孵育：
1）用Parafilm膜制作与膜大小相同的槽；
2）从封闭液中取出膜，1X TBST 5min洗3次；
3）将一抗用封闭液稀释至适当浓度（目的蛋白GluT3 1:300, actin 1:2000）；
4）将膜蛋白面朝上放于槽中，加入抗体，室温下孵育1-2h后（目的蛋白GluT3 1.5 h，actin 1 h），4度过夜， 次日用1X TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5 min。
二抗孵育：
同上方法准备二抗稀释液（目的蛋白GluT3 1:1000，actin 1:1000）并与膜接触，室温下孵育1 h后，用1X TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10 min。
化学发光，显影，定影：
1）将A和B两种试剂等量（常用各500 μL）在5 ml离心管中等体积混合；
打开X-光片夹，铺上保鲜膜，将NC膜面朝上放于保鲜膜上，滴加此混合液1-3 min后（见到荧光），用保鲜膜包好；
2）将1×显影液，自来水和定影液分别到入盘中。
3）在红灯下取出X光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1 cm）；把X光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1 min到5 min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；
4）曝光完成后，打开X光片夹，取出X光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2 min（20～25 ℃），温度过低时（低于16 ℃）需适当延长显影时间；
显影结束后，先用自来水洗一下X光片，然后再放到定影液中进行定影（这样可以延长定影液使用时间，从而节约定影液）。定影时间一般为5～10 min，以胶片透明为止；
凝胶图像分析：
将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
注意事项
1）分离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果。 2）上样蛋白量不应超过30 μg/mm2 (载荷面积：如果你的胶槽是5 mm×1 mm，则载荷面为：1 mm×5 mm=5 mm2)。
3）胶通常在0.5-1 h内凝集最好，过快表示TEMED、APS用量过多，此时胶太硬易龟裂，而且电泳时容易烧胶；太慢则说明两种试剂用量不够或者系统实际不纯或失效。
4）混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形；太慢不均匀，特别是甘油。
5）电泳中常出现的一些现象：
条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好；
条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全；
拖尾：样品溶解不好；
纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒；
条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜；
条带两边扩散：加样量过多。
6）滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>=膜>=胶。
7）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。
8）因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿，而且在以后的操作中，膜也必须随时保持湿润。
9）滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下滤纸一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将靠胶滤纸换新的。
10）转移时间一般为1.5小时 (1 mA-2 mA/cm2，10% gel)，可根据分子量大小调整转移时间和电流大小。
结果分析
将X-光片在凝胶图像分析仪上进行灰度扫描，比较目的蛋白与内参蛋白的灰度值，可得到蛋白表达半定量分析结果，还可根据Marker预测蛋白的分子量。
Western Blot 实验操作教程 - 图文
