生物化学实验报告
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生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称 实验日期 合作者 评分
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血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及其定量
实验地点 指导老师
批改日期
一、实验目得
1、１、学习醋酸纤维薄膜电泳得基本原理与操作方法； 1、2、了解电泳技术得一般原理；
１、3、掌握电泳分离血清蛋白质及其定性定量得方法。
二、实验原理
2、1、血清中各种蛋白质得等电点不同，一般都低于pＨ７、4。它们在pH8、6得缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动.由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带得电荷量不同，在醋酸纤维素薄膜上电泳得速度也不同。因此可以将它们分离
为清蛋白(Ａlbumin）、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β－球蛋白、γ-球蛋白5条区带.
2、2、血清中不同蛋白质得等电点、分子量及含量
血清蛋白质 等电点 分子量 占总蛋白得%
清蛋白 4、64 ６9，0０0 57~72
α1－球蛋白 5、０6 2００，0０0 2～５
α2—球蛋白 5、06 3０0,000 4～9 β－球蛋白 5、12 ９0，000～１5０，０00 6、5～１２
γ—球蛋白 6、８5～7、３ 1５６,000~950，000 12~2０ 缓冲液ｐH=8、6，ｐI＜pH.
血清蛋白带负电荷,在电场中向正极移动。 预测血清蛋白电泳区带图
血清蛋白依次分为清蛋白，球蛋白得α１、α2、β、γ五个区带
2、3、①膜条经过氨基黑1０B染色后显出清晰色带;②各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比；③可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中；④用分光光度法计算各种蛋白质得百分数。
三、材料与方法：
3、1、实验材料：
3、1、1、实验试剂：①样品:健康人血清（新鲜、无溶血);②巴比妥—巴比妥钠缓冲液（pH8、６,离子强度０、０6mol/L）;③氨基黑１0Ｂ染色液;④漂洗液;⑤洗脱液：0、4mol/NaOH溶液。
３、１、2、实验器材：①Ｖ－１100分光光度计(×1）；②恒温水浴箱(×１）;③试管(×6)、试管架(×1）；④1000μL加样枪(×1)、加样枪架(×1);⑤醋酸纤维薄膜（2cm*8ｃm,厚度１20μm）；⑥培养皿(×5)；⑦点样器或载玻片(×１）；⑧平头镊子(×2）;⑨剪刀（×1）;⑩电泳槽（×１)；?直流稳压电泳仪（×１) 3、2、实验步骤
1．准备与点样:①取２×8cｍ得膜条；②亚光面距一端１、5ｃm处取一点样线；③充分浸透在巴比妥缓冲液中；④取出膜条，用滤纸吸去多余得缓冲液；⑤点样器下端粘上薄层血清;⑥垂直点样。 点样示意图： 注意:点样线尽量点得细窄而均匀. — 小组标记 样品标记 8cmm点样线 点样区 (粗面) + 2cm 2.电泳:①放置膜条（点样面向下，点样端置于阴极）;②膜条贴紧滤纸，拉直膜条;③平衡五分钟；④通电（调节电压12０ｖ/电流，时间:４5~60 mｉｎ）；③关闭电源. 1、电泳槽解剖图: 5cm
３、染色、漂洗：①通电完毕；②取出膜条；③浸于染色液(氨基黑10Ｂ）中，5ｍiｎ;④取出膜条，浸于漂洗液；⑤反复漂洗2次,直至漂净；⑥滤纸吸干薄膜。 4、定量(洗脱比色法）(因实验室等原因，未做) 四、结果与讨论：
图一 染色后得膜条
４、1、结果分析
本次实验得到得图谱只能够清晰得瞧出清蛋白与γ—球蛋白得区带,其余无法区别。原因可能如下:
①醋酸纤维薄膜质量不足
②薄膜过湿，样品扩散迅速,导致样品分离不成区带. ③点样太少,区带显色不明显. ④电泳时间不足.
⑤薄膜在缓冲液中浸泡得时间不足。
⑤取出电泳后得薄膜过程中曾不慎将薄膜掉到地上。
⑥染色时，因为现场混乱，可能导致醋酸纤维薄膜不就是一张一张放入染色液得，在染色固定前,薄膜与薄膜之间重叠,造成薄膜上还未固定得血清蛋白彼此粘连.
４、２、课后思考题
1.电泳时,点样端置于电场得正极还就是负极？为什么？
答：点样端置于电场得负极。因为人体血清得蛋白质会因电槽中溶质呈碱性而带负电，要成功分离出各类各类蛋白质,理应将点样端置于电场得负极.
2.电泳后各区带应明显分开,如分离不清或不整齐,试分析其可能存在得原因. 答:①醋酸纤维薄膜质量不足;②薄膜过湿，样品扩散迅速，导致样品分离不成区带;③点样太少,区带显色不明显；④染色时，醋酸纤维薄膜不就是一张一张放入染色液得,在染色固定前，薄膜与薄膜之间重叠,造成薄膜上还未固定得血清蛋白彼此粘连。⑤电泳时电压,电流或电泳过小或时间不够,造成区带未分离。
血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及其定量 实验报告
