葡萄糖和果糖。在培养过程中,先利用葡萄糖,然后利用果糖。 植物细胞和组织在培养基中缺乏自养能力,因此,需要外源碳源提供能量。在培养期间的特殊条件下,即使组织开始变绿或产生绿色色素,培养组织生产的碳源也不能自给自足。将外源碳源加入到培养基后,可增强细胞增殖和绿茎再生能力。
除此之外,糖类的添加还有调节培养基渗透压的作用。 在培养基高压灭菌过程中,部分蔗糖发生水解。但是,培养物在高压灭菌的蔗糖培养基上生长较好,而在过滤消毒的蔗糖培养基上次之。从这个结果可以推论出,高压灭菌使蔗糖水解成葡萄糖和果糖,有利于细胞生长和分化。
在大规模生产中,蔗糖价格太贵,常用食用绵白糖、白砂糖代替蔗糖,但在不同的植物种类上,其使用的可行性及其浓度范围需要做小规模的生产性实验。 4、有机营养成分 (1)维生素
植物合成的内源维生素,在各种代谢过程中起着催化剂的作用。当植物细胞和组织离体生长时,也能合成一些必需的维生素,但不能达到植物生长的最佳需要量。因此,必须在培养基中添加必需的维生素和氨基酸,使植物组织健壮生长。比较常用的维生素是盐酸硫胺素(VB1)、盐酸吡哆醇(VB6)、烟酸(VB3)、肌醇等,盐酸硫胺素是所有细胞和组织必需的基本维生素。烟酸和盐酸吡哆
醇常添加到培养基中,但对许多植物的细胞可能不是必需的。其他维生素如生物素(VH)、叶酸、抗坏血酸(VC)、泛酸钙、维生素E(生育酚)、核黄素和对氨基苯甲酸也常被使用。氨基酸类物质不仅为培养物提供有机氮源,同时也对外植体的生长以及不定芽、不定胚的分化起促进作用。抗坏血酸还有防止组织褐变的作用。 (2)氨基酸
氨基酸是蛋白质的组成成分,也是一种有机氮化合物。常用的氨基酸有甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、半胱氨酸以及多种氨基酸的混合物,如水解酪蛋白(CH)、水解乳蛋白(LH)等。氨基酸类物质不仅为培养物提供有机氮源,同时也对植物体的生长及不定芽、不定胚的分化起促进作用。与无机氮不同,氨基酸能被植物细胞很快吸收。
5、植物生长调节剂 (1)生长素
生长素由茎尖合成,沿植物体向下运输,常用的生长素有吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和萘氧乙酸(NOA)等。IAA和IBA见光易分解,故应置于棕色瓶中,IAA在高温灭菌时会受到破坏,最好采用过滤除菌方法。
在植物组织培养中,生长素的主要作用有:①诱导愈伤组织的产生,促进细胞脱分化;②促进细胞的伸长;③促进生根;④2,4-D会诱
导某些植物不定胚的形成。
生长素通常溶解于乙醇或低浓度的氢氧化钠溶液中。 (2)细胞分裂素
细胞分裂素由根尖合成,沿植物体向上运输。细胞分裂素是腺嘌呤的衍生物。常用的细胞分裂素有6-苄氨基嘌呤(6-BA)、激动素(KT)、玉米素(ZT)、2-异戊烯腺嘌呤(2-ip)、噻苯隆(TDZ)、氯苯脲(CPPU)等。
在植物组织培养中,细胞分裂素的主要作用有:①促进细胞分裂和扩大,使茎增粗,而抑制茎伸长;②诱导芽的分化,促进侧芽萌发生长;③减少叶绿素的分解,抑制顶端优势,延缓离体组织或器官的衰老,有保鲜的效果;④对根的生长一般起抑制作用。
在植物组织培养时,细胞分裂素/生长素的比值控制器官发育模式,若增加生长素浓度,有利于根的形成;增加细胞分裂素浓度则促进芽的分化。
(3)赤霉素(GA)和脱落酸(ABA)
这2种植物生长调节剂不常用于组织培养中。一些植物需要赤霉素和脱落酸增强生长,而在另一些植物中需要它们抑制生长。GA3是20多种赤霉素中最常用的,GA3能促进低密度培养细胞的生长,增加愈伤组织生长,诱导矮化或发育迟缓的植物伸长生长。GA3最好现配现用,过滤灭菌后加入到培养基中。
根据植物种类不同,脱落酸在培养基中刺激或抑制愈伤组织生
长。据报道,脱落酸有利于胚胎培养。脱落酸还有抑制生长、促进休眠的作用,在植物种质资源超低温冷冻保存时,可以用来促使植物停止生长和抗寒力的形成,从而保证冷冻保存的顺利进行。 6、其它物质 (1)天然有机添加物
培养基经常添加各种成分不确定的天然有机提取物。常用的有椰子汁(CM)、酵母提取物(YE)、番茄汁、香蕉泥和土豆汁等。 由于天然有机物质成分复杂,常因品种、产地和成熟等因素而变化,实验的重复性比较差。另外,有些天然有机物质还会因高压灭菌而变性,从而失去效果,这时应该采取过滤的方法进行灭菌。 (2)活性炭(AC)
培养基中添加活性炭的主要作用是利用其吸附能力,减少一些有害物质的影响,例如防止酚类物质引起组织褐变死亡;活性炭使培养基变黑,有利于某些植物生根;活性炭还可降低玻璃化苗的产生频率,对防止产生玻璃苗有良好作用。
但活性炭对物质吸附无选择性,既吸附有害物质,也吸附必需的营养物质,如在非洲菊继代培养过程中,相同的继代培养基,添加2.0mg/L活性炭后,其增殖系数大大降低,因此使用时应慎重考虑,不能过量,一般用量为1~5mg/L。高压灭菌前加入活性炭会降低培养基的pH值,使琼脂不易凝固,因此要加大琼脂用量。 (3)抗生素
培养基中添加抗生素可防止菌类污染,减少培养材料损失。低浓度链霉素和卡那霉素能有效的控制微生物的系统侵染。常用的抗生素有青霉素、链霉素、庆大霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素等,用量一般为5~20mg/L。大部分抗生素需要过滤灭菌。 (4)硝酸银
离体培养基中植物组织会产生和散发乙烯,而乙烯在培养容器中的积累会影响培养物的生长和分化,严重时甚至导致培养物的衰老和落叶。硝酸银中的Ag+通过竞争性地结合于细胞膜上的乙烯受体蛋白,从而可起到抑制乙烯活性的作用。硝酸盐的使用浓度一般为1~100mg/L,使用前过滤除菌。 (5)抗氧化物
植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质,渗出细胞外就造成自身中毒,使培养材料生长停顿,失去分化能力,最终变褐死亡。在木本尤其是热带木本及少数草本植物中较为严重。常用的抗酚类氧化剂有半胱氨酸、聚依稀吡咯烷酮及抗坏血酸,可用浓度为50~200mg/L的抗酚类氧化剂洗涤刚切割的外植体伤口表面,或过滤除菌后加入固体培养基的表层。 (6)凝固剂
由于在静止液体培养中,组织或细胞浸没在培养基中,发生缺氧死亡。在配制固体培养基时,需要使用凝固剂。最常用的凝固剂是琼脂,琼脂是一种来源于海藻的多聚糖,比其他胶凝剂的优点多: