世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版 [精华]
序言：国内外关于原代培养有很多文献，不幸的是，没有一篇是详细的，没有一篇解答过为了让大家少走弯路，根据我杀过请求多投几票得几个叮当。相信你我的标题说的很像吹牛，但是我是严肃认真的说的，note:法，除了最后那一副图是来自下面第（注：附录的图是常用的消化酶对实验的存活率影响，来自下面链接里的文献）原经元的原代培养。生鼠就要新生鼠，不能混淆。比如我回答用新生鼠的实验很少，老鼠，再来问我下面的问题。2首其血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。I的添加剂为是胎鼠培养基，而由于很多初学者操作不熟练，不注意，很多人会污染，所以我还是建议加双抗。成功，但是，切忌中途换培养基，要从一而终。很多实验室是不加抗生素的，也有的实验室加。只差多。所以，人用follow. 降低到如果样品多。除外）验，建议，用清可以抑制神经凋亡。实验室用内几乎没有）一切操作都在冰浴的液体中，所以要多准备冰袋。4情况和密度相关。板中间和边缘成熟度不一样，而这会给实验带来很大干扰。而太小的话（会倾向于向中间集中也会照成发育不均匀。定是要包被，用关分钟接着晾干5少胎，母鼠是多少天的（一般是宫放入冰冷培养液中。一般来说，冰袋笔者选择一面蓝一面白的。的时候，白的那面朝上，这样可以很清楚看到血管膜。从处死老鼠到大脑被剥离出这段是人就会做，层还是海马，中。降到6有一层血管膜。注意：一定要尽可能的去掉所有的血管和血管膜。剥离，而新生鼠则比较难。这里千万不能粗心大意！很难吹打下来神经元，就是失败的，不可能得到高质量的神经元。养中，这些细胞往往会分裂，导致你的培养成果根本不能用。可以说，剥离的不好不干净，实验消化吹打！位。没有详细要求的话一般是取顶端。从大脑到单个海马的剥离我不细说了。段被移入一个小烧杯里，仔细的去除血管膜，原因上面说过。最后，请再仔细检查一下是不是都去掉了。确认后，海马片7消化非常的难以掌握速度，而且消化效果真的是化光了。而胰酶消化的快，还会出现细胞快速破裂释放出组织块外面，使得块里面的不到应有的消化。所以我个人不推荐胰酶。想附图）细胞的个公司的活性不一样，很难有标准浓度，需要摸条件，不过不是很严格，只要能防止就好。木瓜酶的特点是不会消化过头，证神经元的营养代谢，而且一定要现用现配。消沉底，下面消化不足，上面消化的没细胞。笔者的技巧是，这样消化液在培养皿里形成浅而广阔的一层，化酶是由于木瓜蛋白酶温和，因此不会消化过头，使得你的实验消化的很稳定。箱里，每血清的培养液来配置木瓜酶而不是用再过后可以用大）体系8的新生鼠，一鲜培养基和少量的有时候会过细。很缓慢，吹出的时候可以略快，但是也要缓慢。轻柔吹打是细胞成活关键！要用进口枪头，国产我样要冷在冰上）上面，而团块会沉到下面去。上面的那层就是你要的单个悬浮细胞，把它们挪到指定容器里（一骤，轻柔吹打，再静止3步吹打的过程保证了每一个单细胞都避免了过度吹打，胞。重申一下，为了保证最大程度收获活细胞，每次吹打之前，可以加入少量以更容易收获大量高质量细胞，这样反而会使大量细胞死亡。层。9的神经细胞了。但是，由于实验者等个人或者客观原因，能也被吹入了细胞悬液；操作者手法不熟练，到培养的神经元的质量。为了克服这些，笔者查了一些文献，经过反复测试采用了转速密度推荐稀释成细胞，如果你拿到的层和海马可能需要的稀释度稍微有不同。一般来说，一个梯度液体就够用，的上面一层，经过的培养液分界面那一层。而最下面的梯度剂下的沉淀则是细胞团块，血细胞，胞碎片，小胶质细胞。而最上层最浮头，则是细胞碎片。这样，你就得到了最大限度去除了杂细胞，和细这步，但是用这步会效果更好。注意：母液稀释到差别，要摸条件而不是死记硬背。另外皮层和海马浓度也稍微有差别。度一定的情况下，1记住的是，神经元原代培养是细节决定成败，任何一个环节没处理好，整个实验都会失败。胞会大量分裂，导致神经元变得更少，从而得到失败的实验。种板密度过低是非常有害的。首先，神经元互相接触的几率小，难以存活和成熟。其次，胶质细密密度会导致细胞聚团，结果也是细胞不正常形态或者死亡，导致错误或失败的实验结果。笔者的经验是情减少密度）要非常严肃认真！于接触抑制现象，适当密度的神经元可以抑制胶质细胞生长，从而达到理想的实验由我们用的是致莫名其妙的细胞死亡。贵）种受体一般而是有利条件，可以促使神经元贴壁，从而提高存活率。会导致神经元都集中到培养板的孔中间，导致浓度不均，生长不均匀，确的摇法是左右平行翻转角度，然后前后平行翻转角度，千万不要让里面液体画圈！氨酰胺的无血清培养液。很多者的经验来看，这是极端错误的！神经元，流到孔另外一侧再贴壁，直接照成一个孔内细胞分布不均匀，来说这种事情直接实验失败。笔悬液中的大量细胞碎片也会牢牢贴壁，而细胞碎片直接影响神经元存活和正常代谢；另外时后，胶质细胞会开始分裂，这时候就很难抑制了。笔者推荐是注这时候的摇晃可以最大程度去掉细胞碎片。然后，有条件也可以洗两次，但是笔者觉得一次足够。洗了之后吸干液体，换成的培养液清洗一次，也是要轻微摇晃，来进一步去除细胞碎片，从而得到良好的细胞生长环境。胺的神经元专用无血清培养基。对（下面是对版面一些犯错误的研究方法中最严重的错误之一的提醒，这里了。刚如DMEM很多这种培养液都是含有谷氨酸，而且是成经元经历了新×你做鼠和新生鼠虽然形状一样，但是神经元的功能一点都不一样，表达受体都不一样。都是用胎鼠，而新生鼠往往用来培养测一些我新生鼠的问题，我都是说你先看下背景文献是不是你搞错了。而另细胞存活，但对于一些雷到我的，我只能再次说，请收集足够的背景文章在去选择合适材料，祝大家都能培养出健康漂亮的神经元，carefully and seriously! 心）声认为最完美的神经原代培养。最 笔者默认的就是用这个溶液配置的密度梯度。时只有nvitrogen/GIBCO （可选可不选，但是我建议全选）神经元进一步纯化。，培养基选择（：最影响原代培养的成败因素之一：这小段请大家一定注意看。：实验成败的关键之二：消化。一般来说，我看很多人都用.0.×材料选择。一定要严格按照国际上，解剖过程一定要全程在关于培养皿的问题。一般来说，处死母鼠并把胎鼠解剖时候，一定要注意母鼠状态，是否有死胎，胎儿胎盘是不是正常，有多实验成败最关键最关键的：吹打次之后如果还有团块在下面，请果断丢弃。造成这个的原因就是刚才的血管膜没剥好。这个分http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=156&id=17651341&sty=3先，次，为了次，最重要的，血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无意！一个意的事情二： 做一个完美成功的消化，化的技巧：消化时候，很多人有不良习惯，喜欢用个意：次重申：们采用的是最合理的度过高也是很有害的。由于营养争抢，密度过高有可能导致局部细胞营养枯竭死亡。于板注意事项一：种板时候的溶液推荐使用含有谷氨酸的培养液。神经元的意事项二（严格注意）种板后都是要摇晃板摇匀细胞，切记！千万不能圈圈摇晃！意事项三（严格注意）种板后过过一定时间要换成正常标准培养神经元的者的经验是意事项四：于原代培养，是细节决定成败，一个地方不够好会满盘皆输，所以请严肃对待。德国队的回答了一系列形形色色的问题，我把这个问题挑明了说。熟的神经元生鼠不受这个限制，新生鼠原代培养没有有功能的雷到我的，是板上有人用材料非常混乱，一会用胎鼠，一会用新生鼠，一会成年鼠的们这叫对自己不负责任！原代培养的，成年鼠是另外的培养方法，外，在一些药物保护实验中，不要以为是，明，后提醒大家注意：果您不相信×种板。这一步没有那么非常重要，但是如果没认真弄，浓度的不均一也会使得整个实验失败。代。把消化用的培养皿放在冰上冷却，然后垫高一面使得液体集中在另外一面便于吹打。整个×我建议胎鼠取出来的时候胎鼠就放在冰冷的缓冲液中。即使是静止这篇文章全是我个人的经验， NMDA0.5mmol/lPOLY-LYS0.×10neurbasal。这样可以大大提高存活率。在解剖大脑时候，有人用。笔者是配成FGF2×除了最后一幅图是来自别的文献，培由于无血清培养基添加剂不是血清，1血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，最后非常影响神经元产量添加成分谷氨酰胺溶液不稳定，所以每次用时候要现配现加 NycoPrep? 1.07702mg/mlDNA或者×）木瓜酶不要用巯基化合物激活，激活后消化好很多但是成活率坏很多；美金）并去掉了一定的胶质细胞的最干净最纯粹的神经元。×enjoy. 度。-52-33DMEM-L-15养梯度离心。现在这个梯度溶液已经被公司升级为×过多的细胞反而会导致神经元大量死亡。抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷如果你在分钟稍微摇动一下。除了消化过程中要 天后才会出现。FGF2ugly×会导致细胞变化很大，0DMEM-HGfansmmol，避免了释放的1ml，可以全程用B2760%。注意，注意！受体。MEM×我另外，不要取一个分离一个，一定要注意多准备冰袋子。分钟，然后仔细的去掉上层的液体，保留消化过的组织块般的度，神经元还是在进行着很大程度代谢。所以，。由于种板4，血清有复杂的解毒作用而 ugly 610um.培养液来浸泡解剖过程中的脑，因为。下面沉淀下去的细胞团块不要丢弃，再加培养液相当昂贵，所以种板时候是不用它的，而第一次换液才用。一般种板时候木瓜蛋白酶虽然笔者试过，没加这个也正常生长，但是几乎所有文献都添加，neurobasal小时后换液时，请轻轻摇晃板几下再换如果是要的是皮层的神经元原代培养，首先就是收集大量背景文献，孔板每一个孔要有包被，我们是包被没分界线于凌晨）POLY-LYSDNA，就用刚才悬浮细胞的培养液来配置。注意：和谷氨酰胺！neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)一些特定梯度可以分开神经元和少突和其他胶质细胞，血清终止反应是最佳选择高糖或取决于你收获的细胞量多少。浓度的培养液中的谷氨酸还不被毒死，那就是怪事了。大于-A！一定要所有格子都看！ 无血清培养基1ml4-6或者1500和文献不同会导致错误结论，分界线有在解剖过程中，nycoprep(optiprep)的谷氨酸即可照成细胞凋亡，而谷氨酸受体2mg/mlneurobasalnycoprep(optiprep)为新生鼠培养基。不过根据笔者实验，没什么太大区别，都能很轻松培养小时换液，但是千万不能超过被迫多次吹打，酶，吹打摸这其中还有一个问题，就是注意孕鼠处死后要短暂的浸泡酒精消毒，防止污染。蓝枪头分步吹打法×62或者DMEM-F12×转（不是冰上加少量培养液，马血清会抑制神经元凋亡并且抑制胶质细胞生长孔板（比如DMEM-F12+分钟，转移上层的单细胞到刚才指定容器里，一共这样分步吹打在中国能买到，现在可能会有更多浓度供选择，请大家注意换算。 ×索×最好的而还是坚持用+我强烈推荐DMEM-HG所以种板时候有谷氨酸不会导致细胞毒性反应。！由于神经元的成熟速度和接种密度有很大关系，× 或者胶原。×适量的木瓜酶。另外要用的是×。培养出的细胞状态均一，胶质细胞几乎不分裂。其中，要求更小心仔细和特别的处理。we do all cases seriously ×DMEM-F12 DNA过预八成是你自己搞错了实验对象，实验者如果是用的皮层这种原材料充足的话，×因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，就可以达到满意的效果。在一边被垫高的皿里面，加入 ×paper37×尤其是实验材料不足时候。（我是用马血清，便宜，但是切忌不要用国产血清，污染几率很×冷里添加抗生素，记得用量只要标准量的一半培养法相当成熟，所以没必要用难固定的胶原。非常温和。 ×E16-E18，10×DNA度，其余任何时刻都是要浸泡在neurobasal(neurbasal-A)×。这就意味着，从你处死母鼠后，胎鼠的大脑的温度要最快的6。笔者经验是，没有必要用巴斯德管。对于胎鼠和所以还是别用在原代培养中，×1。每个1500099和蛋白缠结在组织块表面而阻碍进一步消化。×307×3000follow胎鼠直到皮层或海马被剪碎的过程，×而是要快速把所有胎鼠大脑都迅速取出放到冰预冷的培养液孔板是最佳选择。神经元让人苦恼的问题是，神经元发育的次。吹打时候要注意，切忌过快，要缓慢吹打。吸入时候要推小时换液，神经元还没有完全贴壁，这时候换液会吹下很多是×的 6CM DISH。2hanks可能有很多浓度，×100000 分钟，吸干晾过夜，然后洗两次，或者只洗一次但是要马血清来浸泡解剖过程中的大脑，来供给大脑的代谢，血木瓜酶造成神经元大量死亡；NCBI我现在以海马神经元为例。欢迎大家来问问题酶。木瓜蛋白酶很便宜请放心。消化过程是 或者1荐行那篇文献，所以我才说是invitrogen不是 9%只老鼠的经验，我把我这几年摸索的经验和大家分享，用剪刀剪成确保你的任何过程都在冰浴的培养液中进行前面所有的经验都是我的原创，小时就换液，理由是胶质细胞贴壁差，会除去。但是笔）这些信息也要严格记录。处死孕鼠后，要立即取出子请注意）我的这篇文章一定会做的很好。+10mmolNGF一原创，经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养B27！如果发现，使得神经元保持营养；缺点是一定要现配而是人工合成的蓝的朝上，可以很清晰看到海马结构。而去除血管膜所以笔者经验是 DMEM-F12+LTD1.077次吹打过后，静止数据库，其他文献的材料一致。胎鼠就要胎鼠，新+DNA看看你的相关要求的国际公认的做法是用哪种。造成死细胞过多，篇个正好我就不多说了。均匀分布着组织块，如果您买到的不是这个密度， 把你收获的细胞悬液小心的加到稀释好的梯度剂没有，双抗对细胞的干扰，无血清培养基要大的就一定对神经有很大作用，笔者的经验是，想要马血清。注意一定要进口的。国产杂质很多会导）会使得中间很难和周围的细胞密度一样，造成级的。--。甚至困惑。文产品序列号，之类的（DMEM（中途冰袋没了的是猪头），那么请换算一下稀释度）值得注意的是，皮很烂！稍微不注意，就会消化过头，细胞都消注意：5-8严重的毒性会影响许多灵敏实验DMEM！！60%酶献L-15（如果是台酚蓝染色只记录活细胞，另外，0.5-1I earn it. 12 NMDA而分布吹打又保证了尽可能多的收获单细血管膜没剥离干净的后果是：计数板细胞不均匀，宁愿重新计数分钟，神经元被高度压缩到梯度面和上面DNA。而皮层的细胞很多，。原因：细胞碎片贴壁很慢而且不牢固，但是 而不是凭借肉眼观察和猜测。 在 。我强烈不建议用血清培养。原因是：50ml木瓜酶是消化过后，小时。原因是：超过只是参考，具体实验室不同可能略微有被认为是最标准，最好的培养基。需要一般来说，收获的细胞悬液已经是很纯血管膜可能不会被完全剥离；细胞请再用没有加血清的，（如果是美女的话，血清浸泡解剖过程中的脑。注意注意：不会再空气中变碱性。没有 消化和吹打非常忌讳操作的细胞过多，之类的培养液，麻烦检查一下你们的立方毫米的小块，not quite sure,DNA10ml我请仔细注意文献中要的是皮层哪一部optiprep.培养液会在空气中变碱性。国外有的就是说，1-1.5mlB27用一个6 很多人写信问我新生鼠的培养问题，硬套胎鼠的原代培养必然导致失败。酶。NycoPrep? 1.077 请确认国际上的相关研究文献所用（请直接用无血清的培养液配来保2 试管装着所有东西。结果是组织都0.125%不过有一点要注意，如果实验者技术精湛，孔板是最佳选择。受体，以hanks hank's到网站上检查下相应的组成公式。1.077）不过成年鼠培养一定要用（也有用血管膜一部分细胞会混入原代培，和其他蛋白缠结成絮状包裹在影响种板等等原因，2梯度离心管中，4-6 DNA4前无论皮层还是海马，上面都是分钟。这时候游离的单细胞在本篇专门讨论胎鼠和新生鼠神可以用解剖显微镜。在所有海马都成功剥离后，从而彻底解决了上述问题。请大家注意，0；。大概是小时，但是别超过稀释时候，99.9%6处死后要迅速把大脑的温度新鲜培养液，重复刚才的步，在其中解剖。根据我的经的无糖环境很不利。我个人度（冰浴）的液体中。消化3被广泛应用于血液中分离血天就开始表达，如果胎鼠神的胰酶消化。实话说，胰酶的 ）木瓜酶一定要现用现配。或酶的作用是，消化掉破裂会直接导致实验失败。从而成熟的不均匀。有些文献曾经报道， 但是笔者从来没成功过。有时候可能需要文献太少）帖10CM 从无数失败总结出的我（N2原创。 neurbasal+B27+96消化时候请在 切忌不要放入过多皮切忌不要放太多皮层而这时候的谷氨酸反子请换算一下。FBS。存活率最高的酶 放置冰上准备消化，NMDA的，0.5-2mmol/l孔或12 所以细胞计数一定给个电话我会很开neurobasal+b27+杂细胞， （NycoPrep? 1.077 以前是最常用的，DNA我把回帖编辑到神经原代培养一培养皿来消化小时，混在细胞另外，也可以，2-4ml 但是推荐DNA2无不管你是用皮，所以有人问）尽量用不含we just simply 128； 20-30please nycoprep还是会影响种板时候用！圈圈摇晃（消化步骤也可以不用等谷氨酸毒1 大部分实验酶。这招可需 L-15DNA101-1.5mlneurobasal8杂细胞可以及部分成年鼠的胎鼠很好稀释过的酶由于各吹打时候孔）细胞另外，小时。 叮372笔者当但是太那么酌大部分！谷氨酰天之内FGF2分钟。 ！小时，的3why. 12B27do 严格在梯（见缠结度温！由当 次。( 高正请消胎30。小国新低谷it 。），
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