DNA提取
1) 取0.1~0.2 g 幼叶片放入液氮预冷的研钵液氮种研磨成粉。加入含有65℃预热的1 000 μl CTAB裂解液和20 μl β-巯基乙醇的2 ml离心管中,65℃水浴裂解40~60 min,每隔10min颠倒混匀一次。然后常温12 000 r/min离心10 min。
2) 取上清,加入2 ml离心管中,加入等体积氯仿:异戊醇(24:1), 旋涡混匀,4℃, 12 000 r/min, 离心10 min。重复这一步骤至界面清晰。
3) 取上清,加入到1. 5 ml离心管, 加入两倍体积-20℃预冷的无水乙醇和1/10体积3M的NaAc(pH=5.2), 小心颠倒均匀,-20℃沉淀10~30 min。
4) 4℃, 12 000 r/min, 离心10 min。弃上清,用70%的乙醇洗2~3次。室温干燥30 min。
5) 加入1μl 10 mg/ml RNase,37℃温浴30-60 min去除RNA。 6) 溶于40μl灭菌的ddH2O,琼脂糖凝胶检测。
注:无水乙醇、NaAc、70%的乙醇预冷
RNA提取
7) 取0.1~0.2 g 植物材料放入液氮预冷的研钵液氮种研磨成粉。加入
含有65℃预热的1 000 μl CTAB裂解液和20 μl β-巯基乙醇的2 ml离心管中,65℃水浴裂解40~60 min,每隔10min颠倒混匀一次。 8) 加入等体积氯仿:异戊醇(24:1), 旋涡混匀静置3 min,4℃, 12 000
r/min, 离心10 min。
9) 取上清800 μl于2 ml离心管中,加入等体积氯仿:异戊醇(24:
1), 旋涡混匀冰上静置3 min,4℃, 12 000 r/min, 离心10 min。 10) 取上清600 μl,加入1/30体积的NaAc(3M,pH=5.2)和1/10体
积的无水乙醇(均预冷),混匀,在冰上静置10 min,再加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),4℃,12 000 r/min, 离心10 min。 11) 取上清450 μl于1.5 ml离心管中,加入1/3体积的LiCl(10M),
-20℃静置沉淀2h。
12) 4℃,12 000 r/min, 离心10 min。弃上清,用预冷的70%乙醇洗
涤沉淀2次,再用无水乙醇洗涤1次,室温干燥。
13) 溶于20μl灭菌的ddH2O,取2μl琼脂糖凝胶检测,存-70℃冰箱备
用。
注:无水乙醇、NaAc、70%的乙醇预冷
DNA--CTAB的配制(50ml) PH 所需用量 1M Tris-HCL 8 6.05g Tris碱+2.1ml HCL 0.5M EDTA 8 EDTA-Na2 9.3g+1.0g NaOH 5M Nacl 14.61g 2%CTAB 1g 2%PVP 1g 1%β-巯基乙醇 0.5ml(现用现加) DNA--CTAB的配制 PH 所取体积或质量(50ml) 所取体积或质量(500ml) 1M Tris-HCL 8 5ml 50ml 0.5M EDTA 8 2ml 20ml 5M Nacl 14ml 140ml(40.908g) 2%CTAB 1g 10g 2%PVP 1g 10g 1%β-巯基乙醇 0.5ml(现用现加) 5ml(现用现加)
3M NaAC 10M LiCl
PH
所需用量
5.2 20.4g NaAC·3H2O或12.3g无水NaAC 21.2g LiCl或30.29g LiCl·H2O