质粒DNA的提取与鉴定
实验日期 2020年5月14日 室温 25°C 成绩
一、实验报告摘要
【实验题目】
质粒DNA的提取与琼脂凝胶电泳鉴定 【实验目的】
1、掌握质粒提取原理和各种试剂的作用。 2、掌握琼脂糖凝胶电泳原理和操作。
二、实验原理
1、质粒：
质粒是独立存在于染色体外，能自主复制并能稳定遗传的一种环装双链DNA，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中。细菌质粒是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内利用宿主细胞的复制机构复制质粒自身的DNA 2、琼脂糖凝胶电泳：
琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法之一，该技术操作简便，快速。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kb的DNA。此外，直接用低浓度的核酸染料进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。琼脂糖凝胶通常采用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。
三、操作要点：
（1）质粒DNA的提取
1、收取细菌：将4mL细菌培养液分为2次加入2mL的塑料离心管(子弹头)内，每次以12000r/min离心1min(注意平衡)弃去上清液。
2、加入100uL用冰预冷的溶液I，用移液枪将细菌沉淀打散成为悬浮液。(溶液 I放置冰中) 3、加入200uL溶液II，盖紧盖口，翻转离心管5次，充分混合内容物，避免振荡，将离心管置于冰上。
4、加入150uL用冰预冷的溶液III，盖紧盖口，翻转离心管，温和摇匀直至粘稠状的细菌裂解物出现，置于冰上5分钟。(溶液放置冰中)
5、用微量离心机12000r/min离心5分钟。取上清液移到另一离心管。
6、加入等量的酚:氯仿(1:1)混合液，轻轻混匀，12000r/min离心7分钟，将上清液收集到新的离心管中。
7、加入2倍体积100%乙醇沉淀DNA，轻轻混匀，1200 0r/min离心5分钟，弃去上清液，倒置在滤纸上干燥，漓尽液体。
8、用1m170%乙醇洗涤DNA沉淀，按照步骤7去除上清液，空气干燥10min。 9、用50uL的无菌水溶解质粒DNA 。 （2）琼脂凝胶电泳分离鉴定
1，制胶。将电泳缓冲液和琼脂糖在微波炉中熔化，混匀，冷却至55°C，加入EB染料，倒入已封好的凝胶灌制平台上，插上样品梳。 2.加入10u1的6x加样缓冲液到DNA样品，混匀，然后用移液器取50u1样品加入样品孔中。(不要漫出加样孔)
3.接通电极，在120V电压下进行电泳20min-30min 。 4.当加样缓冲液中的溴酚兰迁移至足够分离DNA片段 的距离时，关闭电源。
5.已染色的凝胶可以直接在紫外透射仪上观察或照相
四、实验结果：
成功分离DNA片段，能看到超螺旋质粒和单缺口质粒的条带。
五、实验讨论
1.质粒提取溶液I、溶液II、溶液 III各自的成分和作用 （1）溶液I充分重悬，防止DNA裂解：
50 mmo1 / L葡萄糖: 增加溶液黏度，维持渗透压，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部，防止DNA受机械剪切作用降解。 25 mmo1 / L Tris-HC1 (pH 8.0) :维持PH。
10 mmo1 / L EDTA(pH 8.0) :二价金属离子的螯合剂、消除游离Mg2+等二价金属离子，抑制DNA酶的活性。
（2）溶液II裂解细菌，使DNA、蛋白质变性。
0.2mo1/LNaOH:主要作用溶解细胞，释放DNA并使其变性。
1%SDS:阴离子去垢剂。作用:既能裂解细菌细胞膜，又能使细菌蛋白质变性。
质粒DNA具有特定的形态结构，在特殊环境下，如加热、极端PH等，能变性。SDS处理细菌细胞能溶解膜蛋白，导致细菌细胞壁破裂，释放质粒DNA和细菌基因组DNA。
（3）溶液III中和，沉淀杂质，使DNA复性
5 mo1 /L醋酸钾:使钾离子置换SDS中的钠离子，形成PDS (十二烷基硫酸钾)。因为SDS遇到钾离子后变成PDS，而PDS是不溶于水，同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀。染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构，和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀。 冰乙酸:中和Na0H 。
去除变性条件后，质粒DNA能复性，在加入强碱NaOH后，通过酸性的醋酸钾中和碱性溶液，质粒DNA便能迅速复性。需要注意，染色体DNA由于分子巨大在短时间内难以复性，所以，离心后，能将质粒DNA留在上清中，染色体DNA则和细胞碎片一起沉淀在离心管底部。
70%酒精:清洗盐分和抑制DNA酶。
2.实验过程注意事项:
碱裂解法抽提质粒DNA注意:
（1）时间不能过长，在碱性条件下基因组DNA片段会慢慢断裂; （2）必须温柔混合，不然基因组DNA会断裂； （3）提取过程尽量保持低温；
（4）加Solution I后一定充分打散悬浮菌体；
（5）加入Solution I后放置时间不要超过5min，以免变性质粒不易复性；
（6）加入Solution I后液体应由浑浊变为透明粘稠，可见拉丝现象。若没有上述现象发生，则实验不能继续下去，应检查试剂配制及操作是否有误，然后重新开始； （7）提取质粒后应尽量扣干，因为残留的乙醇可能影响后续实验；
（8）不要在污染区放置无关物品，手接触过污染区的任一物品，或是碰触污染区后，均不得碰触其它地方；
（9）实验后，将实验垃圾仍至黄色垃圾袋中，自行清理实验区域。
《分子生物学》质粒DNA的提取与鉴定实验报告
