17β-雌二醇对人肝细胞C-反应蛋白表达的影响
徐海燕1，唐俊利2，钱民章2（遵义医学院 病理生理学教研室1 生物化学教研室2，贵
州 遵义 563003）
[摘要] 目的：研究不同剂量的17β-雌二醇(17β-Estradiol E2)对人肝细胞C-反应蛋白（C-reactive protein CRP）表达的影响以及对人IL-6诱导的人肝细胞CRP表达的干预作用。方法：不同浓度的E2（0.1，1.0，10，100，500，1000nmol/L）作用于L-02肝细胞24h；浓度为0.1，1.0，10nmol/L的E2分别与100ng/mL 人IL-6共同作用24h。均采用Western blot 检测各组细胞内CRP表达情况。结果：0.1，1.0，10nmol/L的E2没有诱导L-02肝细胞CRP表达，但能抑制人IL-6诱导的L-02肝细胞CRP表达，其抑制效应有量效相关性；100，500，1000nmol/L E2可明显诱导L-02肝细胞CRP表达，其诱导效应有量效相关性；结论：高剂量的E2可以诱导L-02肝细胞CRP表达；生理浓度的E2没有诱导L-02肝细胞CRP表达，但可以抑制人IL-6诱导的L-02肝细胞CRP表达，为雌激素替代疗法(estrogen replacement therapy,ERT)的心血管保护作用提供了实验室依据。
[关键词] 肝细胞；C-反应蛋白；17β-雌二醇；白介素-6
[中图分类号] [文献标识码]
Effects of 17β-Estradiol on the expression of C-reactive protein in human hepatocytes
XU Hai-yan1 ,TANG Jun-li2 ,QING Min-zhang2 （Department 0f Pathophysiology1 and Biochemistry2 ，Zunyi Medical College, Zunyi 563003, China）
[Abstract] Objective:To study the effects of 17β-Estradiol (E2) on the expression of C-reactive protein (CRP) in human hypatocytes；To study the inhibitory effects of E2 on the expression of CRP induced by hIL-6 in human hepatocytes. Methods: L-02 hepatocytes that growed vigorously were stimulated with different concentrations of E2 (0.1,1.0,10,100,500,1000nmol/L) for 24h; L-02 hepatocytes that growed vigorously were stimulated with the concentrations of E2 (0.1,1.0,10nmol/L) and hIL-6 (100ng/mL) for 24h..The expression of intracellular CRP was detected by Western blot. Results The concentrations of E2 (0.1,1.0,10nmol/L) can not induce the expression of CRP in L-02 hepatocytes, while it can significantly invert the expression of CRP induced by hIL-6 in L-02 hepatocytes, the inhibitory effects was relative to the dose of E2.;The concentrations of E2 (100,500,1000nmol/L) can significantly induce the expression of CRP in L-02 hepatocytes.,the revulsive effects was relative to the dose of E2 .Conclusions:High dose of E2 can induce the expression of CRP in L-02 hepatocytes; Physiological dose of E2 can not induce the expression of CRP in L-02 hepatocytes, while it can invert the expression of CRP induced by hIL-6 in L-02 hepatocytes.,it could provide the experimental proof for the cardioprotevtive effects
of ERT.
[Key words] hepatocytes ; C-reactive protein; 17β-Estradiol; interleukin-6
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基金项目 贵州省省长科技教育优秀人才基金资助(2005-316) Supported by the Guizhou Governor’s Foundation for Outstanding Scientists
in Science,Technology and Education(2005-316)
作者简介 徐海燕(1979.8-),女,贵州安顺人,硕士研究生,讲师,研究方向:雌激素与心血管
疾病。电话：0852-8609547，E-mail: xhy790813@126.com
通讯作者：钱民章,教授,博士生导师, E-mail: qian_mzh@hotmail.com
CRP属于系统发育上十分古老,结构高度保守的穿透素蛋白家族成员。1930
年,由洛克菲勒大学的Tillett 和Francis 博士在由肺炎双球菌引起的肺炎病人血中发现。CRP主要由肝脏合成, 离体与在体实验均证实[1], IL-6是CRP基因表达的主要诱导者。传统观点认为,CRP 是天然免疫系统的重要组分和炎症标志物。越来越多的医学基础与临床研究显示[2-6]:CRP可以直接诱导炎症,并且是心血管疾病最为有力的预示因子与最重要的危险因子,可以直接参与动脉粥样硬化病理发生的各个重要阶段,促进疾病的发生、发展。
动脉粥样硬化与许多因素有关，除了传统的已确认的因素如高血压、高血脂、吸烟、高血糖、高龄、肥胖，及新近研究发现的如氧化修饰的低密度脂蛋白、高纤维蛋白原血症、高半胱氨酸血症、低一氧化氮等[7]，性别与动脉粥样硬化之间的关系也很值得重视。大量研究发现：雌激素能通过调节血脂代谢、阻止血管平滑肌细胞迁移和增殖、保护血管内皮细胞等作用抗As[8-10]，因此ERT被作为绝经后妇女心血管保护的治疗措施，但ERT的心血管保护作用机制仍有许多尚待研究的问题，甚至有不少争议,特别是与CRP的关系，很值得探讨。最近国外的临床研究报道：健康的绝经后妇女口服低剂量或常用剂量，甚至高于常用剂量的雌激素一定时间后，检测其血清CRP浓度变化，结果表明，低剂量组人群CRP浓度无变化或有一定程度的下降，而常用剂量组和高于常用剂量组人群的CRP浓度则明显升高[11-13]。由此可见，CRP与雌激素之间存在着一定的关系。血清雌激素水平为什么会影响CRP水平，作为As相关因素的雌激素是否会影响CRP基因表达尚未见有关报道。本研究通过观察E2对人肝细胞CRP表达的影响，旨在进一步探讨E2防治动脉粥样硬化的作用机制，为其合理使用提供实验依据。 1 材料与方法
1.1 主要材料
L-02人肝细胞株由武汉大学细胞典藏中心提供；1640培养基购自Gibco公司；
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胰蛋白酶和胎牛血清购自北京华美公司；hIL-6购自PEPROTECH公司；17β-雌二醇购自Cayman公司；兔抗人CRP多克隆抗体和山羊抗人actin多克隆抗体均购自Santa Cruz公司；化学发光试剂购自Pierce公司；PVDF膜购自Millipore公司。 1.2 实验方法
1.2.1 试剂配制 E2溶液：称取27.24mg E2粉剂，加DMSO溶解至10mL，浓度为 1×10-2mol/L，再分别用DMSO稀释成2×10-7mol/L、2×10-6mol/L、2×10-5mol/L、 2×10-4mol/L、1×10-3mol/L、2×10-3mol/L的储备液， 置于-20℃保存。使用前用含 1?S的1640稀释成终浓度为：0.1、1、10、100、500、1000×10-9mol/L，分别 记作E1、E2、E3、E4、E5、E6。对照组培养液中仅含相应浓度 DMSO (0.05%)； hIL-6溶液：将5μg装的hIL-6经1000rpm/min 、4℃、2min离心后，溶于100μL无 菌双蒸水, 使用前用含1?S的1640稀释成终浓度为100ng/mL，-20℃保存。 1.2.2 细胞培养 选用含有10%胎牛血清的1640，置于37℃、5%CO2的孵育箱（美 国SHELL公司）中培养。待细胞长满培养瓶底部70%～80%时，消化传代，取对 数生长期的细胞用于实验。
1.2.3 实验分组 取生长状态良好的细胞，0.25%胰蛋白酶消化后以6×104细胞/ 孔接种于6孔板中，孵育24h后，换为含1?S的1640液作用24h使细胞同步化。 组1分别用E1、E2、E3、E4、E5、E6单独作用细胞24小时，组2分别用E1、E2、 E3与终浓度为100ng/mL的hIL-6共同作用细胞24小时。两组的阴性对照组均为 1?S1640+0.05%DMSO作用组，阳性对照组均为100ng/mLhIL-6+0.05%DMSO作用 组。
1.2.4 Western blot 检测CRP 收集各组细胞，用细胞裂解液提取蛋白后采用Lowry法测定蛋白浓度，调整各样品使其分别含有等量总蛋白。采用常规Western Blot方法检测CRP水平。anti-CRP和anti-actin 抗体浓度均为1：400。膜与各Ⅰ抗室温下共同孵育2h；膜与辣根过氧化物酶标记的相应Ⅱ抗共同孵育1h，最后采用化学发光法进行蛋白条带显色 1.3 统计方法
结果用±s表示，应用SPSS13.0进行方差分析和t检验，量效关系采用相关分
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析，P≤0.05示有显著性差异。
2 结果
2.1 E2对L-02肝细胞CRP表达的影响
用不同浓度的E2（0.1, 1, 10, 100, 500, 1000nmol/L）作用于L-02肝细胞24h，提取细胞总蛋白，采用Western blot检测细胞内CRP表达情况。结果表明：生理剂量的E2没有诱导CRP表达，而高剂量的E2可明显诱导CRP表达，(P<0.01, P<0.01, P<0.01),且与浓度呈剂量依赖关系(R=0.991,P<0.01)。结果见[表1]、图[1]
表1 E2对L-02肝细胞CRP表达的影响（±s ，n=3）
Table 1 .The expressinon of CRP in L-02 hepatocytes with the influences of E2
groups CRP/actin negative control 0 hIL-6+DMSO 1.249±0.133 E1 0 E2 0 E3 0 E4 0.922±0.086* E5 1.409±0.091*
E6 1.787±0.098* *: compared with negative control group p<0.01
25KD-CRP 43KD-actin
阳性对照 阴性对照 E1
E2 E3 E4 E5 E6
图1 E2对L-02肝细胞CRP表达的影响
Fig1 The expressinon of CRP in L-02 hepatocytes with the influences of E2
2.2 E2对hIL-6诱导的L-02肝细胞CRP表达的影响
用生理浓度的E2各剂量组（0.1,1,10nmol/L），分别与终浓度为100ng/mL的hIL-6+0.05%DMSO作用24h, 提取细胞总蛋白，采用Western blot检测细胞内CRP
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表达情况。结果表明：三个剂量的E2对hIL-6诱导的CRP表达均有明显的抑制作用(P<0.05, P<0.01, P<0.01)，且与浓度呈剂量依赖关系(R=-0.857,P<0.01)。结果见表[2]、图[2]
表2 E2对hIL-6诱导的L-02肝细胞CRP表达的影响（±s ，n=3） Table2 The expressinon of CRP induced by hIL-6 in L-02 hepatocytes
with the influences of E2
groups CRP/actin
negative control 0 hIL-6+DMSO 1.390±0.097 E1 1.045±0.024 E2 0.692±0.038
*****
E3 0.443±0.048 *:compared with hIL-6+DMSO group p<0.05 **:compared with hIL-6+DMSO group p<0.01
23KD-CRP
43KD-actin
阳性对照 阴性对照 E1+hIL-6 E2+hIL-6 E3+hIL-6 CRP标准蛋白
图2 E2对hIL-6诱导的L-02肝细胞CRP表达的影响
Fig2 The expressinon of CRP induced by hIL-6 in L-02 hepatocytes with the influences of E2
3 讨论
大量研究表明，雌激素与心血管疾病的发生有密切关系，新近的研究发现，
雌激素会影响心血管疾病的重要预警因子CRP的血清浓度。为了探讨其原因，本实验选择了主要合成CRP的L-02成人肝细胞株作为实验对象，观察雌激素是否会影响CRP基因表达。实验观察了生理浓度的E2[14]和高于生理浓度的E2对肝细胞CRP表达的影响，结果表明：生理浓度范围内的E2没有诱导肝细胞CRP基因表达，而高于生理浓度的E2可以诱导CRP表达,且呈剂量依赖关系。说明E2是诱导CRP
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17β-雌二醇对人肝细胞C-反应蛋白表达的影响
