control stage Ila
pro-apoptosis nuclei（丨期）
图2电产显微镜观察Jurkat细胞凋亡过程中 核染色质的形态学改变
(2) 检测凋亡标记物质
1、磷脂酰丝氨酸外翻分析 (Annexin V法) 磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS) PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，
正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期， 暴露在细胞外环境中(图3)。Ann ex in-V是一种
PS高亲和力特异性结合。将
分子量为 35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与
Ann ex in-V 进行荧光素(FITC、PE)或biot in标记，以标记了的 Annexin-V 作为荧光探针， 利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡
中晚期的细胞和死细胞， PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将 Ann ex in-V与PI匹配 使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
2、 线粒体膜势能的检测
线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，
多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞
发生凋亡，而线粒体跨膜电位的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件， 它发生在细胞核凋亡特征 胞凋亡不可逆转。
线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如
Rhodamine 123、3，
(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细
3-Dihexyloxacarbocya nine iodide[DiOC6(3)] 、 Tetrechloro-tetraethylbe nzimidazol
carbocyanine iodide[JC-1] 、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM) 等可结合到线粒
体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。
将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为
Rhodamine 123(1mM)或终浓
度为 DiOC6(25 nM) , JC-1(1mM) ，TMRM(10 OnM) , 37 °C 平衡 30min，流式细胞计检测细 胞的荧光强度。
3、 TUNEL 法
细胞凋亡中，染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性
3'-OH末端，可在脱
氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性 磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到 DNA 的 3'-末端， 从而可进行凋亡细胞的检测， 这类方
法（称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法 （terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）
。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有
DNA 的断裂， 因而没有 3'-OH 形成， 很少能够被染色。 TUNEL 实际上是分子生物学与形态 学相结合的研究方法， 对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色， 能准确地反应细 胞凋亡典型的生物化学和形态特征， 可用于石蜡包埋组织切片、 冰冻组织切片、 培养的细胞 和从组织中分离的细胞的细胞形态测定， 并可检测出极少量的凋亡细胞， 因而在细胞凋亡的 研究中被广泛采用。 （3） DNA 片断化检测
1、大分子染色体 DNA 片段的测定
细胞凋亡的早期 ,染色体断裂成为 50~300 kbp 长的 DNA 大片段。所有超过一定分子量 大小的双链 DNA 分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。线性 DNA 的双螺旋半径超过凝胶 半径时，即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量的大小来筛分
管一样，以其一端指向电场一极而通过凝胶，这种迁移模式称之为
DNA ， DNA 像通过弯 \爬行 \。因此，细胞凋亡
早期产生的 50~300 kbp 长的 DNA 大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用 脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题。 这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。 每当 电场方向改变后，大的 DNA 分子便滞流在爬行管中，直至新的电场轴向重新定向后，才能 继续向前移动。 DNA 分子量越大， 这种重排所需要的时间就越长。 当 DNA 分子变换方向的 时间小于电脉冲周期时， DNA 就可以按其分子量大小分开。
2、DNA Ladder 测定
细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩 , 染色质 DNA 在核小体单位之间的连 接处断
裂 , 形成 50~300 kbp 长的 DNA 大片段, 或 180~200 bp 整数倍的寡核苷酸片段 , 在
凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱
(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯 DNA ,
DNA ladder。如果细胞
进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的
量很少，还可在分离提纯 DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶 (TdT)使DNA 标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中
DNA ladder的形成。
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3、凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析
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|?8流式细胞术分析PI染色的细JI&IDNA^战的变化
如何在组织中检测细胞增殖，分化和凋亡 - 图文
